El PGH influirá poderosamente en la Biomedicina de los próximos lustros: permitirá avanzar en el conocimiento de la base de muchas enfermedades (Medicina Molecular), y abrirá perspectivas nuevas en el diagnótico, pronóstico y tratamiento, aunque esto último, necesitado de mucha investigación de tipo post-genómico, vendrá con más retraso.
Los ratones se pueden manipular en línea germinal e inactivar de modo dirigido genes. De esta forma se han logrado modelos de numerosas enfermedades humanas, sobre todo las que afectan al sistema inmune y al desarrollo embrionario. Actualmente existen unas 1000 razas de ratones K.O. (noqueados), y obtener cada una de ellas cuesta una media de $ 100.000 y unos 10 meses de desarrollo.
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En 1997 el Instituto Merck de Investigación Genómica anunció que iba a financiar con $ 8 millones a la empresa Lexicon Genetics para crear 150 nuevas razas de ratones K.O. usando una nueva tecnología desarrollada por esa compañía. La Merck pretende que las razas de ratón creadas en el proyecto queden disponibles para los investigadores a un precio nominal. La estrategia de Lexicon consiste en insertar un pequeño trozo de ADN aleatoriamente en células madre embrionarias. El ADN insertado inactiva la función del gen donde se inserta, y junto con algunas secuencias adyacentes transcribibles del ratón, suministra un sitio-etiqueta único. Luego se recupera esa etiqueta, de modo que se puede averiguar la identidad del gen inactivado. |
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Durante los próximos 3 años, Lexicon pondrá a trabajar robots de alto rendimiento para generar unos 500.000 clones mutantes de células madre embrionarias de ratón, cantidad suficiente para que cada gen quede marcado e inactivado una media de 5 veces. Las células clonadas se guardan en nitrógeno líquido. Para final de este año se espera disponer ya de 50.000 clones. Cualquier investigador con un gen clonado o secuenciado podrá consultar la base de datos OmniBank para localizar los clones que lleven una inserción inactivadora en el gen en que trabajan. Las células de ese clon o clones se descongelan y se usan para crear el correspondiente ratón transgénco K.O., del que se estudiará el fenotipo a nivel anatomo-histológico, fisiológico, etc. (Volvemos a remitir al lector al artículo publicado en "Nature" (vol 392: 608-611 [1998])con un ejemplo de cómo esta empresa está aplicando este método prometedor. |
El avance en el PGH y en los mapas y secuencias ya disponibles impulsan la necesidad de disponer de técnicas capaces de rastrear ADN en busca de mutaciones asociadas con enfermedades humanas. En los próximos años se habrá identificado la mayor parte de los genes implicados en importantes enfermedades humanas. En las bases de datos se están introduciendo informaciones sobre mutaciones y sus implicaciones clínicas. Uno de los retos de la medicina será hacer uso de esa información para mejorar el diagnóstico y prognosis de las enfermedades.
Para detectar mutaciones en sitios previamente determinados se han diseñado una serie de métodos:
| Hibridación de oligonucleótidos específicos de alelos |
| Amplificación específica de alelos (con o sin PCR, o con reacción en cadena de la ligasa, LCR) |
| Procedimientos que crean o destruyen sitios de restricción. |
| La detección de mutaciones en lugares sin especificar o cuando no se dispone de información de secuencia es una tarea muy ardua, aunque se han desarrollado algunas estrategias (rastreo de malos emparejamientos en el genoma). |
| Sin embargo, lo más frecuente es la situación en que se trata de identificar mutaciones en múltiples sitios potenciales dentro de segmentos de ADN de los que se conoce la secuencia normal. |
| Se han diseñado técnicas de tipo "multiplex" que permiten la búsqueda de diversos tipos de mutantes en un determinado gen. |
De modo ideal, el procedimiento tendría que ser fiable, rápido, barato, y proporcionar información exacta sobre la posición y naturaleza de la mutación, así como requerir poco esfuerzo, ser automatizable y no usar reactivos peligrosos. Ninguno de los métodos actuales cumple este criterio. La secuenciación sería el método definitivo, pero sigue requiriendo mucho trabajo, y los métodos automatizados de alto rendimiento son caros. De todos modos, debido a que hay mucho interés y dinero puesto en el empeño, se puede casi garantizar que veremos importantes avances en breve.
Por ejemplo, se está desarrollando un sistema que no usa electroforesis en gel (una de las fases más tediosas), llamado espectrometría de masas por láser de desorción/ionización asistida por matriz
La división Applied Biosystems de Perkin Elmer ha diseñado un análisis de hasta 32 mutaciones diferentes de un gen por amplificación simultánea de hasta 15 segmentos de ADN, seguida por ligado multiplex de oligonucleótidos específicos de alelos.
La misma empresa ha creado un ensayo de micro-PCR que puede realizar 24 ensayos de 2ml cada uno en un chip, y cuyos resultados se pueden leer en tiempo real por medio de la estrategia de TaqMan.
Otro de los avances más prometedores son los "chips" de oligonucleótidos: ordenaciones de diferentes oligos unidos a soportes semisólidos. ADN marcado fluorescentemente puede entonces hibridarse a los oligos del chip, de modo que el patrón de hibridación se puede analizar por scaning de fluorescencia. Como se conoce la secuencia y posición de cada oligo en el chip, se puede determinar la posición y posiblemente la naturaleza de cada mutación.
Este enfoque de microchips con oligos ha sido llevado a un avance importante por la empresa Affimetrix: usando técnicas fotolitográficas similares a las que emplea la fabricación de chips de silicio, se han podido obtener chips con 64.000 diferentes sondas de oligonucleótidos unidos a superficies planas de cristal. En 15 minutos el dispositivo puede detectar la hibridación de secuencias diana marcadas fluorescentemente a oligos del chip.
Otro caso notable de nuevas perspectivas que se pueden abrir con el diagnóstico molecular es el Proyecto de Anatomía Genómica del Cáncer que pretende realizar un catálogo de todos los genes expresados en los distintos tipos de células tumorales. Se trata del último ejemplo de matrimonio entre ciencia genómica e informática, con consecuencias trascendentales en el ámbito clínico. Los investigadores quieren determinar cómo cambia la expresión génica conforme progresa el cáncer y comprender cómo surgen los tumores. Se espera que se pueda obtener un índice genético de los tumores, de modo que el clínico no sólo dependa de anatomía patológica convencional (microscopía), sino que el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de sus pacientes se pueda asentar en un conocimiento más adecuado a base de la expresión génica y de las proteínas. La idea de que se puedan identificar todos los genes alterados en un cáncer determinado es muy atractiva. Debería realmente suministrar información para clasificar tumores e identificar dianas para la terapia.
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Ó 1997
ENRIQUE IAÑEZ PAREJA. Permitida la reproducción para uso educativo y sin ánimo de lucro.