Se acaba de graduar como licenciado en Biología por la Universidad de Granada
2. Desarrollo de la terapia génica
2.1 Genes ajenos integrados en el cromosoma del animal receptor
2.2 Los transgenes pueden ser regulados por los pratones de tejido específico
2.3 La expresión transgénica puede ser dirigida a tejidos específicos
2.4 Transgenes utilizados para matar tipos celulares específicos
2.5 Los retrovirus pueden ser utilizados para esbozar linajes celulares
El concepto de terapia génica podemos abordarlo desde diferentes deficiones como son:
 | " Es la introducción de material exógeno (natural o recombinante) en sujetos humanos para corregir deficiencias celulares expresadas en el nivel fenotípico." |
| Es una estrategia terapeútica basada en la modificación del repertorio genético de células somáticas mediante la administración de ácidos nucleicos y destinada a curar tanto enfermedades de origen hereditario como adquirido. " |
| " Es la transferencia de material genético nuevo a células de un individuo dando lugar a un beneficio terapeútico para el mismo. " |
Aunque estas deficiones rozan lo meramente descriptivo, la terapia génica engloba un amplio rango de posibilidades que no pueden ser incluidas en una descripción tan general.
Actualmente el término terapia génica se ha visto "aumentado" con el tiempo hasta incluir transferencias génicas de naturaleza preventiva y aquellas que contribuyen al avance de la investigación médica. Lo cual roza mucho con confusiones al respecto del término que inicialmente se le dio . Cabría preguntarnos si la terapia génica dista mucho más de la expresión de " intervenciones estrictamente terapeúticas en el ser humano ", ya que la controversia del término nos lleva a pensar cosas totalmente distintas. En el transcurso de este trabajo iremos perfilando ideas sobre la problemática que rodea a dicho concepto.
Así se lleva a pensar desde diversos colectivos de expertos en bioética, medicos , etc , que el término de terapia génica debería sufrir nuevas modificaciones:
En cuanto a todas las ideas y puntos de vista que rápidamente surgen al conocer estas nuevas definiciones, las trataremos más profundamente en diversos apartados.
La terapia génica se presenta como una promesa terapeútica de utilidad en todo tipo de patologías, la cual probablemente revolucionará nuestra concepción de la medicina. El surgimiento de la terapia génica ha sido posible gracias a la confluencia de los avances del conocimiento en campos tales como: Biología Molecular, Genética , Virología, Bioquímica, y Biofísica entre otras.
El estudio conjunto de todas estas ciencias pretende dar respuesta a las siguientes preguntas:
| ¿Cuál es la naturaleza del producto génico? ¿Es un ácido nucleico? ¿ Es una proteína? Si es así, ¿Es secretada , donde se localiza, cuánta cantidad se requiere, y durante cuánto tiempo? |
| ¿Cuál es el tejido diana? ¿ Es un tipo particular de célula? ¿ Es una célula fácilmente accesible? ¿ El estado de la enfermedad la deja más o menos accesible? |
| ¿ Está la célula en división o no ? |
| ¿ Es posible el tratamiento in vivo o ex vivo? Esto es, ¿ Pueden las células ser separadas y tratadas ex vivo, como en todos los primeros protocolos o pueden , o deben, ser tratadas in situ? Si las células son tratadas ex vivo, ¿Serán readministradas como un neoórgano separado o serán colocadas en su localización normal? Si es un neoórgano, ¿Comprenderá células de la misma o de distinta especie? |
| ¿Es requerida la expresión del gen de forma temporal o permanente? ¿Será la célula devuelta tratada? ¿Eliminará la célula tratada una aplicación acertada? |
| ¿Es necesario el tratamiento de todas las células en un órgano o tejido?¿ Habrá un efecto permanente? ¿ Tendrán las células tratadas una ventaja selectiva ? |
Desde estas simples consideraciones, se sigue que los requerimientos para cualquier aplicación varian en gran manera e influirán profundamente en la elección de un vector para ser desarrollado y testado. Los factores que requerirán ser testados incluyen la eficacia de la transferencia del gen , la duración de la expresión del gen, la capacidad para repartir la dosificación, y la capacidad para dirigirse a las células apropiadas y evitar las inapropiadas. Los factores desconcertantes que puedan aparecer, incluyen la incapacidad del vector para entrar o integrarse en los cromosomas celulares, el cierre de los promotores transcripcionales, la pérdida del ADN introducido, la destrucción de las células tratadas y la neutralización del vector insertado o del producto génico. Todos estos factores dependerán fuertemente de la elección del vector y de la capacidad del hospedador para responder a dicho vector.
Determinados descubrimientos en el campo de la Biología Molecular han hecho posible el desarrollo de la terapia génica.
Los primeros experimentos surgieron en la introducción de genes en levadura y células de mamífero en cultivo tisular. El reto estaba en qué habría que hacer si quisieramos estudiar el control genético del desarrollo de un organismo superior, donde las interacciones celulares juegan un papel crucial.
Los primeros animales superiores en que se utilizaron estas técnicas fueron ratones. Estos experimentos se basaban en las técnicas del ADN recombinante. El ADN ajeno o extraño era inyectado en embriones tempranos y era incorporado a los cromosomas de algunas células embrionarias y mantenidos en ellos , con su consiguiente proliferación y diferenciación en células tisulares adultas . También se hicieron experimentos en los que el ADN ajeno podía integrarse en la línea germinal. Una vez que la clonación de genes fue posible se podía microinyectar en embriones tempranos de ratón el ADN deseado.
La mejor técnica era aquella en la que se microinyectaban genes clonados en un óvulo fertilizado con dos pronúcleos, uno masculino y otro femenino que serán los que darán lugar al núcleo del embrión unicelular. Cientos de copias del ADN extraño disueltos eran inyectados directamente en uno de los dos pronúcleos y después el embrión inyectado sería transferido al útero de la madre adoptiva, y se espera que finalice el desarrollo embrionario.
El porcentaje de zigotos que sobrevivieron a la manipulación y el desarrollo variaban entre el 10-30% . De los supervivientes el número de individuos que presentaban ADN extraño en sus cromosomas era del 2-40% . El ADN extraño aparecía integrado al azar sin preferencia por un lugar concreto en los cromosomas .
A estos ratones se les llamó ratones transgénicos, y al ADN inoculado se le llamó transgén .
Se supo que el ADN inyectado podía ser estable tanto en células somáticas como germinales.
En ratones derivados de embriones inyectados con ADN de interferón humano clonado o con ADN de la beta-globina del conejo, se vio que transmitían estos transgenes a su descendencia como un rasgo mendeliano, junto a sus demás genes.
Todos los ratones derivados de un único progenitor forma una línea de ratones en la que cada miembro poseía los mismos transgenes y en la misma posición del genoma. Lo que posteriormente se intentó conocer o determinar es que si esos transgenes adquiridos se expresaban, y en ese caso, si su expresión está apropiadamente regulada . Estos experimentos se llevaron a cabo más adelante con células totipotenciales ( en células embrionarias del blastocito del ratón ), las cuales se podían cultivar en un cultivo tisular pero manteniendo intacta su capacidad de diferenciación. A estas células se les introducía el ADN deseado por transfección plasmídica o por infección retroviral. Estas células transgénicas se inoculaban en el tejido diana, en el cual por sus condiciones características podían diferenciarse a células del tipo de tejido en el que se encontraba pero transportando en su interior los neogenes.
Como las células totipotenciales pueden ser manipuladas in vitro antes de inyectarlas en el embrión, los genetistas de ratones podían utilizar la recombinación homóloga para producir ratones transgénicos con mutaciones en genes específicos o reemplazar genes mutados por su equivalente normal.
Aunque un transgén integrado en una localización cromosómica distinta a la de su duplicado endógeno, normalmente se expresa,de manera que mimetiza la expresión del gen endógeno.
El ARN codificado para la insulina humana puede ser diferenciado fácilmente del ARN trranscrito por los genes de la insulina del ratón. Cuando ratones transgénicos del gen de la insulina humana eran analizados, el ARN de la insulina humana sólo se encontraba en el páncreas y no en otros tejidos. Esto significa que la transcripción de los transgenes de la insulina humana era inducida por las mismas señales que inducían a los genes endógenos de la insulina del ratón, es decir, que responde a lasmismas señales reguladoras que los genes endógenos.
Los transgenes pueden interrumpir la función de los genes endógenos, pero en muy raras ocasiones. Los transgenes interrumpen esas funciones de genes endógenos cuyo producto es requerido para una embriogénesis normal. Las anormalidades resultantes nos pueden dar pistas sobre el proceso del desarrollo a partir de los genes cuya función se ha interrumpido. Una líneas de ratones transgénicos (S) fue creada usando una molécula de ARN recombinante comprimida de un virus del tumor de mamas del ratón (MMTV) , LTR y con el gen c-myc de ratón. Cuando el ratón heterozigótico se reproducía algunos de sus descendientes tenían anormalidades en los miembros anteriores y posteriores. Esto demostró que hubo cosegregación de la zona MMTV-myc y confirmó que la integración del transgén dañó al gen endógeno. El fenotipo de los ratones homozigóticos se asemejaba a una conocida mutación de un locus llamado ld para la deformación de los miembros, luego encontraron alelos para el locus ld a los que se les llamó ld"Hd" (Harvard).
La localización cromosómica de la inserción de ld"Hd" fue determinada y comparada con la ld. El ADN integrado con MMTV-myc era usado como etiqueta para clonar ADN de la región de inserción de la región ld"Hd". Luego, se vio que descendientes ld/ld"Hd" tenían deformidades idénticas a los de ld"Hd"/ld"Hd", lo que demostraba que los dos loci eran alélicos.
De este modo, la inserción transgénica puede ser utilizada no solo para la identificación sino para clonar genes importantes para el desarrollo.
La introducción de genes en tipos celulares específicos es una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo del ratón. En otro tipo de experimentos, el operón para un gen expresado en una célula diferenciada específica es usado para restringir la expresión de un gen de una toxina exclusiva a esa célula. Solo el tipo celular específico es matado, y los efectos de la ausencia de estas células en el desarrollo del ratón pueden ser analizados. Por ejemplo, el gen para la elastasa 1 se expresa sólo en el páncreas exocrino, y sus secuencias reguladoras son usadas directamente en la expresión de la cadena de la toxina diftérica A, en esas células. Veinticinco ratones transgénicos eran obtenidos, y siete de ellos carecían de un páncreas normal. Por microscópio se descubrió que algunos ratones poseían un páncreas rudimentario en el que la parte exocrina era altamente anormal.
Experimentos similares de ablación celular se han hecho usando otras secuencias promotoras. Las del gen del cristalino ( lente proteíca ) han sido utilizadas en la expresión directa de la cadena de la toxina diftérica en células de la lente del ojo en desarrollo.
Una dificultad en esta aproximación, es que el gen de la toxina es activado tan pronto como la célula activa al gen endógeno. Si esto ocurre tempranamente en el desarrollo, la ablación de algunas líneas celulares podía ser letal para el desarrollo. En cambio, un sistema inducible para una muerte selecitva de células se ha descubierto al unir el gen de la timidina quinasa del herpesvirus1 (tk), a secuencias promotoras de iniciación de células específicas. Las células que contengan ese transgén no se mueren hasta que se les añaden los nucleósidos sintéticos. Los nucleósidos no son tóxicos, pero la tk del herpesvirus metaboliza esos nucleósidos en productos que matan a células en división.
La siguiente técnica ha sido utilizada para determinar la relación de linaje en la pituitaria anterior. Se cree que las células que sintetizan prolactina derivan de una célula precursora que sintetiza hormona del crecimiento (HC). Las células productoras de HC y las de prolactina de la pituitaria anterior eran utilizadas como células diana en ratones transgénicos usando tk con ambas sustancias.
Seguido a la inyección de los nucleósidos sintéticos, animales con promotores HC unidos a transgenes tk, crecían formas enanas y carecían de células sintetizadoras de HC y de las que sintetizan prolactina, pero a los que tenían transgenes prolactina-tk eran normales. La primera conclusión de este estudio es que las células formadoras de prolactina no se dividían, ya que si lo hiciesen morirían por los nucleósidos metabolizados. La segunda es que las células formadoras de HC debían ser las precursoras de ambos tipos de células, ya que el ratón donde se mataron las células formadoras de HC, perdió sus células formadoras de prolactina.
Los estudios de linajes celulares han sido realizados por introducción de marcadores génicos en ratones recién nacidos. Los retrovirus son vectores eficientes en transportar genes a las células. Los virus Moloney Murine-Leukemia recombinantes han sido fabricados sustituyendo sus genes gag, pol y env por el gen lacZ de E. coli. Células que contengan este virus recombinante integrado en su ADN pueden ser identificadas por microscopio por tinción. El objetivo de estos experimentos es liberar al marcador vírico a una zona particular en un embrión o animal joven, infectando así un número limitado de células. De cada célula infectada se obtiene un clon de células que contenga el marcador vírico integrado.
Las distribuciones y tipos de células teñidas del clonado proporciona información del linaje celular que tienen con las células de las cual se ha obtenido. Esto se ha hecho particularmente en estudios del desarrollo de la retina. El marcador vírico se inyecta entre la retina y el epitelio pigmentado en el día del nacimiento o en los siete días despùés del nacimiento. Seis semanas después se hacían secciones tisulares que se teñían con X-gal (azul) , y se vio que una pequeña cantidad de virus formaba agrupaciones de células teñidas de azul, y que eran las que procedían de una sola célula infectada.
Podemos señalar que algunos clones tenían más de un tipo celular, demostrando así que un único precursor puede dar distintos tipos celulares. Hay algunos problemas con esta técnica. Por ejemplo, algunas células que llevan marcadores víricos puede que no expresen la beta-galactosidasa y el virus no puede ser encauzado a una célula en particular.
Hay métodos alternativos, que incluyen inyección directa de marcadores con dextranos fluorescentes, lo que se ha hecho con Xenopus, y que es difícil hacerlo en embriones de mamíferos.
Todos estos experimentos en ratones están encauzados para la futura aplicación de la terapia génica en humanos. Por todo ello son una base indispensable para el desarrollo de futuras iniciativas en terapia génica y para contraste de resultados y pruebas de inminentes proyectos.
Los vectores son sistemas que ayudan en el proceso de transferencia de un gen exógeno a la célula, facilitando la entrada y biodisponibilidad intracelular del mismo, de tal modo que este pueda funcionar correctamente. Se han utilizado una gran variedad de vectores con fines experimentales, pero todos ellos pueden ser clasificados en: vectores virales y vectores no virales.
En este análisis, consideramos los sistemas de vectores basados en cuatro grupos de virus diferentes: retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y herpesvirus. De manera clara, los virus pueden ser utilizados como vectores en la terapia génica, al menos bajo circunstancias ideales. La pregunta que debe ser contestada es, ¿qué barreras hacen posibles en el presente que limiten la asplicación de estos vectores víricos?
Los retrovirus comprenden una gran clase de virus desarrollados que contienen ARN de cadena sencilla como genoma viral. Durante el ciclo de vida vírico normal, el ARN vírico se transcribe a la inversa para producir ADN de cadena doble (gracias a la acción del enzima reversotranscriptasa) que se integra en el genoma de la célula hospedadora y se expresa en períodos prolongados. Como resultado, las células infectadas vierten virus de forma constante sin daño aparente en la célula hospedadora. El genoma viral es pequeño (aproximadamente 10 kilobases) , y su organización prototípica es muy sencilla, comprendiendo tres genes que codifican:
| gag, el grupo específico de antígenos, proteína de la cápsida y de la matriz sin actividad enzimática. |
| pol , la transcriptasa inversa, proteasa e integrasa. |
| env , proteínas de la envuelta del virus (transmenbrana y superficial). |
Los extremos del genoma cuando ya es ADN son llamados LTRs, ( long terminal repeats) e incluye actividades promotoras incrementadoras y secuencias involucradas en la integración.
El genoma también incluye una secuencia necesaria para el empaquetamiento del ARN vírico, otras secuencias para el corte y empalme entre donador y aceptor y para la generación de ARNs mensajeros envueltos de forma separada.
De forma importante, la mayoría de los retrovirus se pueden integrar sólo en células que se replican, aunque el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) parece ser una excepción. Esta propiedad, poseida por la mayoría de los retrovirus, restringe claramente su uso como vector para la terapia génica.
Los retrovirus han sido estudiados de forma intensa en los últimos veinte años, en parte porque una categoría de retrovirus causa tumores en animales. Esta capacidad de causar tumores y trasnsformar las propiedades de desarrollo de las células en un cultivo, se entiende bien ahora, y está basada al menos en dos mecanismos básicos:
| El primero es que ciertos virus han incorporado protooncogenes activados que por una mutación han adquirido la capacidad de transformar el desarrollo celular. La habilidad del retrovirus para transformar células por este mecanismo no es asunto de importancia en la terapia génica, porque los oncogenes son siempre suprimidos de los vector. |
| El segundo mecanismo de transformación por retrovirus, resulta de una mutagénesis insercional sobre la integración de un genoma vírico. Debido a que el LTR vírico tiene actividad promotora e incrementadora y está presente en ambos finales del genoma, la inserción de una secuencia de LTR adyacente a un protooncogén celular puede llevar a una expresión inapropiada de una proteína involucrada en la regulación celular. Este mecanismo fue estudiado extensamente en la activación del gen c-my por el virus de la leucosis aviar (ALV). |
Si los vectores retrovíricos para la terapia génica se integran en el genoma humano de forma aleatoria , la mutagénesis insercional ocurrirá con cierta frecuencia. Esto podría llevar a la activación del protooncogén o a la ruptura de un gen supresor de tumores. En la práctica, de cualquier forma, los hechos adversos atribuidos a la mutagénesis insercional son extremadamente bajos, quizás reflejando la observación de que la mayoría del genoma humano no está codificado y esa transformación oncogénica lleva consigo normalmente muchos hechos mutagénicos.
Esencialmente. los vectores de retrovirus son relativamente simples, conteniendo en los extremos 5' y 3' secuencias LTR, una secuencia de empaquetamiento y una unidad de transcripción compuesta por el gen o genes de interés. Para desarrollar este vector, se deben suministrar las funciones perdidas del virus en "trans" usando la así llamada línea de células envase. Esta célula está creada para contener copias integradas de los genes gag-pol-env, pero no la señal de empaquetamiento, así las secuencias del virus ayudante no llegan a ser empaquetadas. Rasgos adicionales añadidos o quitados del vector o la línea de célula envase reflejan intentos de hacer los vectores más eficaces o reducir la posibilidad de contaminación del virus ayudante.
La principal ventaja de los vectores de retrovirus es que se integran y son capaces, potencialmente, de una expresión a largo plazo. Pueden ser desarrollados en cantidades relativamente grandes, pero hay que tener precaución para asegurar la ausencia del virus ayudante.
El rango de hospedadores del vector puede ser manipulado, pero su aplicación a células que se replican es limitada. Todavía quedan dudas acerca de la posibilidad de la mutagénesis insercional.
Los adenovirus comprenden una gran clase de virus no desarrollados que contienen ADN lineal de cadena doble. El ciclo de vida normal del virus requiere la división de células y lleva consigo una infección productiva en células tolerantes durante la cual grandes cantidades de virus se acumulan en el núcleo. El ciclo de infección productiva lleva cerca de 32 a 36 horas en el cultivo celular y comprende dos fases, la primera, la más importante para la síntesis del ADN, la segunda, durante la cual las proteínas estructurales y el ADN vírico son sintetizados y ensamblados en viriones. En general, las infecciones de adenovirus están asociadas con enfermedades benignas en humanos.
El genoma del adenovirus es más grande ( sobre 35 kilobases ), y su organización es más compleja que la de retrovirus. De las cuatro primeras unidades transcripcionales, cada una tiene un promotor separado , y codifica ARN mensajero empalmados de varias formas. La última unidad transcrita codifica proteínas requeridas para la formación del virus. La transcripción es secuencial en la que los genes E1 se expresan pronto, y en parte activan la transcripción de otros genes tempranos . La función de las proteínas tempranas tiene varias categorías: por ejemplo, la proteína E1 rescata células de la quiescencia, dejándolas capaces de sintetizar ADN vírico rápido y proteínas, usando predominantemente las funciones del código del hospedador. Los genes E3 codifican funciones para detener los mecanismos de defensa de la célula hospedadora, por ejemplo, para anular los efectos del factor del tumor necrótico (TNF) en células infectadas y bloquear el transporte de proteínas nacientes de clase I del MHC, así reducir la presentación de nuevos péptidos víricos sintetizados por el sistema inmune del hospedador. Los genes E2 codifican proteínas involucradas en gran manera en la replicación del ADN.La región E4 es compleja en su transcripción y codifica funciones que regulan la transcripción entre las fases primaria y secundaria del ciclo de vida vírico.
Los adenovirus han sido estudiados también de forma intensa en un pasado reciente. Las razones son dobles:
| la primera es que el genoma vírico comprende varias unidades de transcripción que interactúan, y son los suficientemente complejos para ser interesantes, también lo suficientemente simples para permitir un análisis molecular detallado. Como resultado, muchos conceptos importantes en la Biología Molecular eucariótica se establecieron primero en los estudios de adenovirus, como el corte y empalme de ARNs mensajeros. |
| la segunda razón es que los adenovirus también pueden transformar las propiedades de desarrollo de células cultivadas y formar tumores cuando son inyectados en roedores recién nacidos. Este proceso resulta de la infección de adenovirus en células no permisivas. Bajo estas circunstancias, algunas expresiones tempranas de un gen y la síntesis de ADN ocurren, pero muy poco, después resulta la expresión de la proteína y la no producción de virus. En cambio en una pequeña proporción de las células infectadas de forma frustrada, el ADN vírico se integra y resulta la expresión de los genes tempranos. La expresión constitutiva de las proteínas E1a y E1b, como en una infección productiva, anula la actividad supresora del tumor de las proteínas Rb y p53, en este caso de forma fortuita lleva una transformación del crecimiento celular. También están involucrados factores adicionales. Por ejemplo, algunos serotipos de adenovirus, como el Ad12, son más oncogénicos que otros, como el Ad2 y el Ad5. Esta capacidad del adenovirus de transformar células en cultivo no se contempla como un gran problema en las aplicaciones de la terapia génica, porque a pesar de investigaciones extensas los adenovirus no han estado nunca asociados la aparición de tumores de forma natural, ya sea en humanos o en animales y porque los genes que transforman el E1 están exentos de la mayoría de los vectores defectuosos de adenovirus. |
Los vectores de adenovirus son algo más grandes y complejos que los retrovirus o vectores de virus adenoasociados (AAV), en parte porque solamente una pequeña fracción del genoma vírico es eliminado de los vectores más corrientes. Si otros genes fueran eliminados, necesitarían ser provistos en "trans" para producir el vector, lo cual se ha comprobado que es difícil. En vez de eso, dos tipos generales de vectores basados en adenovirus han sido estudiados, la supresión en los vectores de E3 y E1. Algunos virus de tipo salvaje que están en los almacenes de los laboratorios carecen de la región E3 y pueden creceran ausencia de un virus ayudante. Esta capacidad no significa que la producción del gen E3 no sea necesario en el salvaje solo que la copia en células cultivadas no la requieren. La supresión de la región E3 permite la inserción de secuencias de ADN exógeno para producir vectores capaces de una infección productiva y la síntesis transitoria de cantidades relativamente grandes de proteínas.
La supresión de la región E1 discapacita al adenovirus, pero estos vectores pueden ser todavía desarrollados porque allí existe una línea celular humana establecida ( llamada 293 ) que contiene la región E1 de Ad5 y que expresa de forma consecutiva las proteínas de E1. Aplicaciones más recientes de la terapia génica que involucran a adenovirus han utilizado la reposición de vectores E1 desarrollados en células 293.
Las principales ventajas de los vectores de adenovirus se resumen en que son capaces de transferir el gen episomal de forma eficiente en una amplia cantidad de células y tejidos y que son fáciles de producir en grandes cantidades. La principal desventaja es que la respuesta del hospedador al virus parece limitar la duración de la expresión y la capacidad de repetir la dosis, al menos con altas dosis de vectores de primera generación.
El AAV es un virus muy pequeño, muy simple, no autónomo, que contiene ADN lineal de cadena sencilla. El virus requiere la coinfección con adenovirus u otros para replicarse. El AAV está extendido en la población humana, como evidencian los anticuerpos al virus, pero no está asociado con ninguna enfermedad conocida.
La organización del genoma es extremadamente simple, comprendiendo sólo dos genes:
| rep, que codifica una familia de proteínas superpuestas involucradas en la replicación e integración. |
| cap, que codifica una familia de tres proteínas estructurales víricas. |
Los extremos del genoma comprenden repeticiones terminales (TR) de cerca de 145 nucleótidos.
Los AAV de tipo salvaje pueden integrar su ADN en el cromosoma del hospedador en ausencia del virus ayudante. Esta integración puede ocurrir con más frecuencia en regiones del cromosoma 19 y está involucrada la proteína rep.
Los vectores de base AAV son extremadamente simples. Contienen sólo las secuencias víricas TR que bordean la unidad de transcripción de interés. El único problema parece ser que la longitud del vector ADN no puede exceder mucho de la longitud del genoma viral con 4680 nucleótidos. Generalmente, el desarrollo de vectores AAV es voluminoso y lleva consigo la introducción en la célula hospedadora, no solo del propio vector, sino también de un plásmido que codifica rep y cap para proveer de las funciones de virus ayudante.
La ventaja potencial del vector AAV es que parece capaz de una expresión a largo plazo en células que no se dividen, posiblemente aunque no necesariamente porque el ADN vírico lo integra. Los vectores son estructuralmente simples, y pueden de todas formas provocar menos respuesta de la célula hospedadora que del adenovirus. Su principal limitación en el presente es que los vectores son difíciles de desarrollar en grandes cantidades.
El virus presenta un material genético compuesto por ADN bicatenario lineal de 100 a 250 Kb. En el virus del herpes simplex ronda las 50 Kb. mientras que en citomegalovirus las 220 Kb.
En la mayoría de los casos el virus presenta dos trozos de ADN bicatenario lineal unidos dando una estructura única llamadas molécula L y molécula S. Poseen en sus extremos secuencias repetidas terminales ( TRL y TRS ) que son los sitios mediante los cuales permite unirse a las dos moléculas. Así, al unirse pueden hacerlo en diferentes orientaciones según la combinación de las diferentes secuencias creando así cuatro posibilidades o también llamados isómeros.
El potencial de estos virus como vectores génicos recae en la habilidad de llevar grandes secuencias de ADN extraño insertadas y su habilidad para establecer infecciones latentes de larga duración en las cuales el genoma del virus existe como un episoma con efectos no aparentes en la célula hospedadora . Los herpesvirus son , de cualquier manera, enormemente diversos, variando en su tamaño de genoma, en la organización del genoma, en el contenido genético, en las células sobre las que actúa y la patogénesis, y en consecuencia diferentes herpesvirus tienen muy diferentes usos potenciales en reparto de genes. La naturaleza de la latencia viral es de particular relevancia. El virus de Epstein-Barr y otros miembros del gamma-herpesvirus pueden establecer infecciones latentes en células en división; el episoma viral se replica coordinadamente con la división celular y está heredado por toda la progenie de células. Como retrovirus, este grupo de herpesvirus tiene el potencial para repartir genes a células pluripotentes y su progenie diferenciada. Un inconveniente mayor al uso de estos virus en terapia génica, de cualquier manera, es el hecho de que gamma-herpesvirus están asociados con daños linfoproliferativos y en algunos momentos con malignidad .El uso de gamma-herpesvirus requerirá la identificación y eliminación de estos genes involucrados en la transformación celular y el mantenimiento de aquellas funciones necesarias para la replicación del virus y el mantenimiento del plásmido viral.
En contraste a los gamma-herpesvirus, el virus del herpes simplex (HSV), y otros miembros de alfa-herpesvirus, no pueden mantener una infección latente en células en división. El genomas del virus no contiene un origen de latencia de la replicación del ADN y el virus persiste en el hospedador por el establecimiento de infección latente en células de larga duración neuronas sensoriales en el caso del HSV. Los genes repartidos usando un vector del virus del herpes simplex pueden por lo tanto mantenerse indefinidamente como un componente del episoma latente viral en células de larga duración , pero la herencia de los genes reaprtidos a las células hijas de la siguiente generación podría ocurrir sólo como resultado de una fortuita integración no específica. Un tercer grupo de herpesvirus, los beta-herpesvirus o citomegalovirus, pueden tener potencial como vectores génicos para la terapia génica, pero nuestro desconocimiento de la biología de estos virus, y en particular la naturaleza de la infección latente, es escasa y no hay proyectos inmediatos de explorar este potencial.
Aún así algunos herpesvirus están siendo probados en el reparto de genes extraños y terapia génica, aunque hasta ahora sólo se han utilizado los virus del herpes simplex (HSV) in vivo.
La secuencia nucleotídica del virus del herpes simplex ha sido determinada,también todos los productos génicos han sido identificados, y la mayoría de las funciones de los productos génicos se conocen por lo menos hasta el nivel superficial. La infección productiva comprende la expresión de todos los genes conocidos en una cascada temporal de tres fases. Los genes tempranos codifican proteínas reguladoras de las cuales algunas son esenciales para la infección del ciclo; los genes tempranos codifican enzimas necesarios para la síntesis del ADN viral y para modificar proteínas de la célula hospedadora ; los genes tardíos codifican las proteínas del virión. El ciclo productivo termina con la muerte celular siguiendo después de una infección in vivo. Los eventos que llevan a una infección latente se conocen muy poco, pero virus mutantes para el ciclo de infección productiva pueden iniciar y establecer una latencia neuronal aunque la infección también es posible en otras células. La infección latente en neuronas expresa una familia de transcritos desde el promotor LAT pero las funciones de estos transcritos se desconoce, y la interrupción o delección del promotor LAT no previene la infección latente. Las conclusiones pertinentes para la construcción del vector es que las funciones de los genes no virales parecen neceasarios para el establecimiento o mantenimiento del estado latente.
De los aproximadamente setenta genes de HSV más de la mitad son dispensables para el crecimiento en el cultivo celular. Los productos génicos dispensables incluyen activadores transcripcionales, enzimas modificadoras de nucleósidos y nucleótidos, una proteína quinasa y algunas proteínas de membrana de función desconocida. Estos genes representan múltiples convenientes para la inserción de secuencias ajenas y su delección resulta muy variable dependiendo de los niveles de atenuación. Muchos otros genes que se han identificado cuya delección resulta en una atenuación dramática , y es posible formar vectores competentes y que son completamente apatogénicos. Mientras estos vectores son necesarios en la investigación sobre los problemas del reparto de genes y de la expresión genética a largo plazo, es improbable que los vectores competentes replicativos sean aceptados para uso clínico. En concreto, la atenuación a través de la delección de múltiples genes se encauzará para fabricar generaciones de virus que sólo están parcialmente atenuados si la recombinación debiera ocurrir con el HSV residente en el hospedador.
La función de algunos genes de HSV son absolutamente necesarios para la repliación del virus y la delección de estos genes necesita de la correspondiente función " in trans" de la célula ayudante. Mutantes de HSV combinados con células ayudantes se basan en un número de funciones génicas que carecen del regulador transcripcional para genes inmediatamente tempranos (IE3), del transactivador vírico Vmw65 (VP16) y de un número de glicoproteínas de superficie esenciales. La atenuación se ha enfocado hacia vectores carentes del gen IE3 porque la función es requerida durante el ciclo productivo, pero otros genes IE son expresados, de hecho hiperexpresados, ante la carencia de IE3 y se ha visto que los productos génicos de IE son citotóxicos. Los vectores que carecen del transactivador vírico (VP16) ofrece la ventaja de que esa proteína actúa activando la transcripción de todos los genes inmediatamente tempranos y que además es una esencial componente de la estructura del virión.
El ADN del HSV se replica por el mecanismo del círculo rodante y los plásmidos que contengan un origen de replicación de HSV actuarán como un modulador para la síntesis de ADN en células coinfectadas con HSV . Si el plásmido también contiene una señal de empaquetamiento de HSV, entoncés el concatémero lineal será empaquetado en partículas virásicas.
Los plásmidos de este tipo se les llamó amplicón. La replicación del amplicón y empaquetamiento es dependiente de un virus auxiliar y la progenie infectiva es una mezcla del amplicón empaquetado y del virus auxiliar , que no pueden ser físicamente distinguidos ni separados. Siempre que el virus auxiliar sea defectivo para la replicación, la propagación de la mezcla amplicón-virus auxiliar requiere una línea celular completamentaria, entonces el virus auxiliar componente de la mezcla no representa riesgo y puede ser ignorado para el propósito de la transferencia de genes. La ventaja de este sistema, es que el amplicón pueda acomodar una secuencia extraña que se aproxima al límite de empaquetamiento del HSV ( aproximadamente 150 Kb ). Estos amplicones empaquetados pueden repartir gran cantidad de genes o algunas copias de pequeños genes por partículas. La desventaja común de todos los sistemas auxiliares dependientes, es que el radio del auxiliar-amplicón varía considerablemente en su tránsito y por eso es difícil preparar colonias de vectores reproducibles.
Este se ha mostrado como un método efectivo de transferir genes tanto in vitro como in vivo . En este método físico el plásmido de ADN es primero revestido sobre su superficie de gotas de 1 a 3 micras de diámetro de oro o tungsteno. Estas partículas son aceleradas por una descarga eléctrica de un aparato o por un pulso de gas y son " disparadas" hacia el tejido.
Un acercamiento menos invasivo es por el bombardeo directo de partículas en la piel. La fuerza física del impacto supera la barrera de la membrana celular. Sin embargo, características de rigidez de los diferentes tejidos, la procedencia del ADN extraño, y la capacidad de transcripción intrínseca conducen a grandes variaciones en la eficiencia de la expresión de los genes en conjunto. En experimentos sobre epidermis de rata, tejidos musculares, hígado y páncreas se ha observado que el ADN extraño de la célula no llega a integrarse en el genoma de las célula hospedadora, y existe como un episoma relativamente inestable. Esto podría sugerir aplicaciones limitadas de esta tecnología en la terapia génica, pero sería útil para investigaciones en la expresión de construcciones de ADN en tejidos específicos.
El requisito para un procedimiento quirúrgico en sujetos humanos de igual modo está muy limitado a la hora de usar esta tecnología. De cualquier manera, las técnicas quirúrgicas de endoscopía podrían hacer menos incoveniente estas limitaciones descritas.
Finalmente un desarrollo factible de este método puede ser aplicado en su uso directo como parte de un protocolo de vacunación. Como demuestran las investigaciones de Ulmer y colaboradores en la inyección directa en el músculo, del gen que codifica la proteína de matriz del virus influenza A. El individuo (en este caso ratón ) manifestó una respuesta de protección inmunitaria frente al virus en posteriores infecciones.
Por este método el ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente es directamente inyectado dentro del tejido deseado.
En experimentos llevados a cabo por Wolff y colaboradores mostraron niveles significativos de expresión en el uso sobre células del músculo esquelético para construcciones de genes chivato o genes trazadores. La longevidad de la expresión se mostró persistente durante al menos 60 días en las inyección con ADN, aunque con ARN y proteínas tuvo una vida media menor que 24 horas. Mediante análisis con Southern blot se sugirió que el ADN se encontraba como un episoma circular cerrado no replicativo.
El mecanismo preciso de captura del ácido nucleico a través de la membrana celular muscular fue postulado como resultado de una serie de características estructurales favorables de células multinucleadas, retículo sarcoplasmático y un extenso sistema tubular transverso. Gracias a éste el contenido extracelular es penetrado profundamente en la célula facilitando la transferencia del ADN.
Así el método de inyección de ADN directamente es simple, económico, y un procedimiento que no es tóxico comparado con la entrega mediante virus. El potencial para llevar largas construcciones de ADN es también ventajoso. De cualquier manera, los niveles y persistencia de la expresión de genes es probablemente demasiado corta (días) . Esta tecnología puede tener potencial como un procedimiento de vacunación, y como expresión de genes a un nivel bajo. Si es suficiente para alcanzar una respuesta inmunológica.
Por otro lado, sería inaceptable considerar una corrección extendida de daños miopáticos tales como la Distrofia Muscular de Duchenne por múltiples inyecciones en muchos grupos de músculos en repetidas ocasiones.
La técnica recae en las propiedades de carga eléctrica del ADN (negativo debido a la cadena de fostatos en la doble hélice), lípidos catiónicos (carga positiva) y la superficie celular (una red de cargas negativas debido a los residuos del ácido siálico).
Así, lo mismo que hacen las histonas (proteínas ricas en aminoácidos cargados positivamente que compactan el ADN), los lípidos catiónicos interaccionan con las cargas negativas del ADN condensándolo. El exceso de cargas positivas permiten a los transportadores catiónicos interaccionar, mediante enlaces electrostáticos con las cargas negativas que presenta la membrana celular.
Cualquiera que sea la naturaleza del vector, sus interacciones con el ADN son imprescindibles. La mayor parte de los equipos mezclan de manera empírica vector y ácido nucleico, formando un complejo que contiene , en general, varias moléculas de ADN. Estos complejos vector catiónico/ ADN tienden a agregarse y observados al microscopio electrónico tienen un diámetro de 50 a 150 nanómetros. Únicamente una condensación controlada del ADN permitiría la formación de partículas que encerrarán una sola molécula de ADN. Esto reduciría su diámetro a una veintena de nanómetros, lo que facilitaría considerablemente su paso a los compartimentos vasculares, así como la penetración en las células y su núcleo. Decir también que el hecho de que el ADN esté compactado lo protege de las enzimas ( nucleasas ) capaces de degradarlo.
Así lípidos monocatiónicos tales como DOTMA (N(1-(2,3-dioleyloxy)-propyl)-NNN-trimethylammonium chloride) y los péptidos policatiónicos de segunda generación como DOPSA (2,3-dioleyloxy-N-(2(sperminecarboxamido) ethyl)-NN-dymethyl-1-propanaminium trifluoroacetate) forman liposomas que se unen espontáneamente a polianiones de ADN o ARN. El resultado es la captura del 100% de los complejos estables de ploinucleótidos, y por atracción de cargas y por propiedades de fusión, los lípidos pueden absorberse a la membrana celular y entregar el ácido nucleico directamente dentro del citoplasma, evitando la ruta de degradación lisosomal.
Pero, ¿cómo logran que los complejos transfectantes entren en las células? Al igual que muchos virus en sus ciclos infectivos interaccionan con proteínas azucaradas de la membrana plasmática, los complejos transfectantes con carga neta positiva, parece que utilizan estas moléculas de superficie para fijarse en la célula. Luego, las interacciones electrostáticas les permiten la penetración.
In vitro, la etapa de penetración en la célula no plantea problemas. Las moléculas comerciales son extremadamente eficaces sobre cultivos celulares se acercan muchas veces al 100%. In vivo, sin embargo, su eficacia cae considerablemente para, a veces, llegar casi a cero. Así, después de la inyección por vía intravenosa de complejos cargados positivamente, se constata que la transferencia de genes tiene lugar principalmente hacia las células del pulmón y del hígado. Esta biodistribución sugiere que los complejos transfectantes se agregan en partículas de gran tamaño, ya que , sin duda, interaccionan con proteínas de la sangre. Por tanto,no pueden abandonar eficazmente el sistema vascular: las partículas son retenidas mecánicamente por unos filtros naturales, los pulmones yel hígado, y penetran en las primeras células que encuentran.
En el tratamiento de la fibrosis cística, Alton y colaboradores desarrollaron una preparación con un ADNc para el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis cística (CFTR) y un liposoma catiónico DC-chol/DOPE (3beta-N-N' , N'-dimethylamino ethanecarbamoyl) cholesterol/dioleoyl phosphatidylethanolamine). Esta combinación lipídica ha sido aprobada en pruebas en humanos e in vitro ha mostrado al menos tanta eficacia como DOTAP ( N-(1-( 2,3 -dioleoyloxy) propyl)-N,N,N,-trimethylammonium methyl-sulphate) o DOTAP/DOPE. Se comprobó que su aplicación no provocaba signos de inflamación o necrosis en el tejido. Además el ADNc era expresado en ARNm por RTPCR y aunque algunos ratones tratados corregían completamente la deficiencia, otros sólo tenían una corrección parcial, así que se obtienen limitadas conclusiones a la hora de su alicación en humanos. Tal vez, los tejidos más intensamente estudiados para el desarrollo de liposomas catiónicos sean las paredes de los vasos arteriales.
Las enfermedades cardiovasculares son las causas más comunes de morbilidad y mortalidad en las sociedades industrializadas . Sistemas en la entrega de ADN-liposomas mediante catéteres son factibles, pero son limitados por una baja eficiencia de transfección y por la toxicidad, pero a pesar de todo los sistemas de ADN-liposomas son usados.
Según Nabel y colaboradores una posibilidad para aumentar la dosis de liposomas catiónicos sería pronosticar un aumento en la eficiencia de transfección, aunque se ha demostrado que puede ser limitado por la toxicidad celular a concentraciones crecientes. Para dirigir este problema se ha informado recientemente de la creación de un nuevo liposoma catiónico, el DMRIE (dimyristyloxy-propyl-3- dimethyl-hidroxyetilammonium/ DOPE).
Aunque el aumento de la eficiencia de transfección de DMRIE/DOPE con respecto a DC-chol/DOPE fue más tarde de lo esperado.
El mecanismo de cómo la proliferación de células aumenta con la transferencia y expresión de liposomas mediados con ADN es simple especulación. Una propuesta para esta hipótesis es que la rotura de la membrana nuclear de la célula diana que ocurre durante la mitosis puede liberar en el citoplasma factores nucleares que estabilizan el ADN. El ADN transfectado puede entonces ser protegido por estos factores de la digestión por nucleasa de la célula hospedadora por una combinación de partición estructural y/o intracelular.
El futuro de la entrega de genes mediante liposomas catiónicos en sistemas cardiovasculares parece prometedor en la luz de estos recientes desarrollos.
La proporción de lípidos con respecto al ADN/ARN, también como la concentración total tiene que ser cuidadosamente optimizada para evitar toxicidad observada con elevadas dosis. Este método es usado en general como un eficiente propósito para transfectar ADN dentro de una amplia variedad de líneas celulares de crecimiento en cultivos de tejidos.
Varios estudios han demostrado la eficiencia de liposomas policatiónicos en el reparto de ADN in vivo. Este método es una alternativa atractiva a los métodos de transferencia viral debido a que no hay obligaciones en el tamaño del ADN, baja inmunogenicidad y fácil volumen de preparación.
En los métodos anteriormente descritos el problema es que el ADN termina por el conjunto del organismo y no a sus objetivos específicos debido a que no posee la capacidad de introducirse en su tejido diana. Para ello - lo mismo que en vectores víricos - se pueden transplantar al transportador de los ligantes, unas moléculas que serán reconocidas por los receptores presentes en el tipo celular elegido. La naturaleza de los ligantes es muy variada , desde azúcares, péptidos, hormonas, etc. Su interés es que son capaces de sustituir por una interacción transportador/célula muy específica, la no específica debida a las cargas iónicas.
Las células absorben los elementos del medio exterior por endocitosis: su membrana se repliega hasta formar una vesícula, el endosoma. Los complejos de transfección aprovechan este mecanismo para penetrar en sus objetivos celulares. El interior del endosoma se acidifica progresivamente y luego se fusiona con otra clase de vesícula llamada lisosoma . Éste contiene enzimas que degradan su contenido. Por tanto, una vez en el endosoma, los complejos deben necesariamente escapar de él antes de ser vertidos en los lisosomas y sufrir su ataque enzimático. Por esto, a los vectores sintéticos se les asocia unas moléculas, llamadas fusiógenas, que desestabilizan las membranas del endosoma y les permite evadirse. A fin de que la actividad fusiógena se manifieste únicamente después de la entrada en el endosoma, se eligen unas moléculas cuya actividad sólo tiene lugar cuando el medio se acidifica.
Una vez en el citoplasma, todavía es necesario que el ADN llegue al núcleo de la célula. Introducido en células en crecimiento (especialmente células en cultivo), el ADN penetra en el núcleo durante la división celular, cuando se rompe la envoltura nuclear. Pero en las células en reposos- estado en el cual se encuentran la mayor parte de las células del organismo- la envoltura nuclear constituye una barrera que únicamente deja pasar, por difusión , las moléculas cuyo tamaño sea inferior a 9 nm. Las moléculas cuyo tamaño está comprendido entre 9 y 25 nm. pueden penetrar en el núcleo valiéndosed de los poros de la membrana nuclear.
En tal caso, se trata de un transporte activo que necesita el reconocimiento de unas señales especiales llamadas señales de localización nuclear (NLS). Pero la implantación de este tipo de señal en un vector sintético no ha mejorado la eficacia de la transfección. Además, recordemos que la mayoría de los complejos de transferencia miden más de 25 nm. Actualmente, esta etapa del transporte nuclear es la más difícil de resolver, a pesar de que es objeto de muchísimos estudios.
Otro problema: si el vector ha de permanecer asociado al ADN hasta el interior del núcleo, hay que asegurarse de que su presencia no interfiera con la transcripción del gen introducido. Así, por ejemplo, complejos a base de polímeros (polietilniminas) inhiben poco o nada la transcripción del transgén. En cambio, los transportadores catiónicos a base de lípidos inhiben esta transcripción cuando presentan un exceso de cargas positivas.
Además de los problemas de vectorización del ADN a las células-objetivo, hay otros elementos cruciales, como el mantenimiento duradero del gen terapeútico en las células -necesario si se desea tratar una enfermedad genética- y la regulación de su expresión según las necesidades del organismo.
Para asegurarse el mantenimiento del gen, una primera solución eficaz es la integración del transgén en el genoma del huésped. Idealmente, esta integración debería tener su objetivo muy bien fijado, pero esto todavía no se consigue. En efecto, una integración al azar en el cromosoma puede hacerse mediante otro gen e inactivarlo. Otra vía de integración es el mantenimiento de las construcción genética, el plásmido, en la forma llamada episomal, llegada al núcleo, pero no integrada en el genoma del huésped, se replicarán con las divisiones celulares. Para conseguirlo, se emplean sistemas desarrollados por virus tales como el de Epstein-Barr. Y una tercera posibilidad : introducir en la célula-objetivo minicromosomas artificiales (MAC) estables y que se replican de modo autónomo.
Este tipo de receptor es específico para hepatocitos. El hígado es de gran importancia en el metabolismo del cuerpo, por tanto es obvio que sea diana para las terapia génica, también muchas enfermedades son debidas a deficiencias en enzimas hepáticas.
Como describíamos para los liposomas catiónicos, el ADN es empaquetado en un complejo electrostático, se usa " asialoorosmucoid-polylysine" (ASOR-PL) en lugar de lípidos.
Así el receptor es cruzado y unido con el conjugado de policatión y ligando e interactúa con el policatión de ADN, y son eficientemente unidos a los ASGPrs en la superficie del hepatocito. La purificación cuidadosa de los conjugados de ASOR-PL es esencial, y a su vez hay que optimizar la proporción del conjugado y el ADN. Una vez que se ha alcanzado esto, es relativamente económico y simple el procedimiento para llevar a cabo una inyección periférica intravenosa, evitando así la necesidad de cateterizar un vaso de forma selectiva.
Dos ventajas significativas son la baja inmunogenicidad del complejo y la habilidad para transferir fragmentos grandes de ADN (más de 48 kb) . La baja inmunogenicidad permitiría múltiples inyecciones, que debería ser casi seguro para las construcciones de ADN actuales, ya que la eficiencia de la expresión del gen in vivo es relativamente baja, y cae rápidamente con el tiempo.
Un ejemplo de la aplicación de este sistema ha sido la bajada del colesterol en suero seguido al reparto de los genes que codifican los receptores de las lipoproteínas de baja densidad (LDLr).
Anteriormente comentabamos el método de entrada, mediante endocitosis mediada por receptor, y escape del endosoma antes de la fusión con el lisosoma. En este caso las sustancias empleadas en esa inhibición de la unión con el lisosoma son una droga antimalaria (cloroquinina) que aumentan la supervivencia del ADN por inhibición de la acidificación del endosoma.
También se han usado proteínas de la cápsida de adenovirus que facilitan la entrada por endocitosis, y ya en el interior se dan vesículas recubiertas de clatrina.
El mecanismo de cómo la cubierta de la vesícula compuesta por estas partículas adenovíricas inhiben la acidificación es todavía incierto. Lo único que se conoce es la capacidad de rotura del endosoma .
Actualmente la vía de investigación intenta descubrir proteínas víricas y péptidos sintéticos que tengan propiedades de rotura del endosoma.
También se están llevando a cabo un sistema que combina las ventajas de los liposomas de llevar ADN de gran tamaño con las propiedades de fusión del virus HVJ o también llamado virus Sendai que no es patógeno en humanos. El ADN es condensado por mezcla con proteínas no histónicas de cromosomas de alta movilidad del grupo-1 (HMG-1).
Estas proteínas parecen aumentar la eficiencia de la translocación nuclear y la expresión seguida a la fusión de la superficie celular. A este complejo ADN-HMG-1 se le añaden lípidos neutros (colesterol, fosfatidil colina, fosfatidil serina). La proporción de lípidos usados es crítica para la formación de buenos liposomas. El virus Sendai se inactiva por una breve exposición a irradiación ultravioleta, y se mezcla con el complejo ADN-HMG-1 cubierto por liposomas.
Este método ha sido desarrollado para el reparto en paredes vasculares, hígado, riñón. El método es eficiente, fácil de llevar a cabo, requiere un tiempo corto de incubación y tiene un tamaño del ADN ilimitado. Aunque la transfección es eficiente en estos tejidos se necesita una cateterización en vasos como pueden ser la vena porta del hígado, arteria renal, coronarias, etc.
La principal desventaja tiene que ver con el uso de virus Sendai intactos, a pesar de que tenemos como garantía que no es patógeno en humanos, y da una duración corta en la expresión y en el reparto de los transgenes. Se debe a que el ADN como ya dijimos permanece como un episoma inestable en la célula hospedadora.
Las investigaciones se centran así en el aumento de la estabilidad del ADN y/o la integración para mejora los proyectos de expresión a largo plazo. Así una posibilidad se centra en la ventaja del reparto conjunto del ADN con proteínas. Así, la estabilidad del ADN procedería de un recubrimiento con proteínas de cromosomas y/o otras proteínas nucleares.
Se hicieron intentos con la proteína recA , una recombinasa de bacterias para intentar una integración en el genoma de la célula hospedadora. Pero los resultados resultaron ser un fracaso. Aunque recientemente se ha visto que diferencias en la parte amino-terminal pueden ser la causa de este fallo.
Así en conjunto este tipo de vectores para la transferencia de genes in vivo están en una fase rápida de desarrollo. Su producción es sencilla y segura, son estables y pueden contener construcciones genéticas de gran tamaño. Son eficientes en el reparto de los genes.
Por lo que podrían ser incorporados a prácticas clínicas. Pero sin embargo, su eficacia in vivo es actualmente decepcionante, seguramente porque el conocimiento de los mecanismos que intervienen es todavía insuficiente. Pero sin duda el día en que podamos superar las limitaciones de estos sistemas serán el campo dentro de la terapia génica con más aplicaciones, beneficios terapeúticos y costes de manipulación y construcción.
Los vectores víricos están hechos al menos de dos componentes, el genoma vírico modificado y la estructura del virión que lo rodea. La mayoría de los vectores de la generación presente comprenden partículas víricas basadas en gran manera en el tipo de estructura del virus sin cultivar. Esta estructura envuelve y protege al ácido nucleico viral y provee los medios para unirse y entrar en las células dianas. De todas formas, el ácido nucleico del virus en un vector diseñado para la terapia génica es cambiado de muchas formas. Los objetivos de estos cambios son discapacitar el crecimiento del virus en las células diana mientras se mantiene su capacidad para desarrollarse en forma de vector en el envoltorio asequible o células auxiliares, dar espacio en el genoma vírico para la inserción de secuencias de ADN exógeno e incorporar nuevas secuencias que codifiquen y capaciten la expresión apropiada del gen de interés. De esta forma, podemos considerar que los ácidos nucleicos del vector comprenden dos elementos: esas secuencias víricas esenciales que permanecen y la unidad de transcripción para el gen exógeno.
Ya que cualquier secuencia que permanezca del virus que codifica, podría ser expresada , incluso por un vector viral discapacitado, todas las secuencias víricas no esenciales deberían ser eliminadas. Así, idealmente, un vector contendrá sólo aquellas secuencias de ácido nucleico de virus necesariamente requeridas en cis. De todas formas, todas las demás funciones viralesson necesarias para permitir la replica del genoma del vector para los propósitos de producción y provisionamiento de las proteínas necesarias para ensamblar el virión. Idealmente un envase específico o célula auxiliar deberia ser construido para que exprese aquellas funciones víricas capaces de funcionar en trans. En la práctica, la expresión de las proteínas estructurales del virus y de las proteínas implicadas en la replicación a menudo resultan tóxicas para una línea celular, particularmente si el ciclo de vida del virus incluye una ayuda, entonces la infección productiva producirá la muerte celular más que una infección crónica. Así, la línea celular de envoltura apropiada requiere desarrollar muchos vectores idealizados que no existen. Los rasgos mínimos esenciales presentes en generaciones de vectores víricos se discuten a continuación.
Ya que las células toleran la presencia de proteínas constitutivas de retrovirus, la generación de líneas celulares envolventes o células de ensamblaje que expresen todas las proteínas víricas es relativamente clara. En consecuencia, los vectores de retrovirus sólo necesitan contener los elementos nucleicos en cis. Estos incluyen las secuencias LTR 5' y 3' y la secuencia de ensamblaje (algunas veces referida como ) que se establece aguas abajo de LTR 5'.
La región esencial de 5' contiene numerosas funciones víricas, incluyendo muchas envueltas en la replicación e integración del ácido nucleico, secuencias promotoras e incrementadoras, un sitio de unión del ARN de transferencia cebador (PBS) y un sitio donador de empalme. Esta región también abarca los codones de iniciación para la proteína gag, el cual en el caso del virus MoMLV incluye una corriente ascendente, que encuadra CUG que codifica una variante de la proteína gag glicolisada con una extensión N-terminal, así como la más usual AUG.
LTRs de varios retrovirus, que incluye aquellos con especificidad para especies diferentes, han sido usados con éxito para generar vectores de retrovirus. Incluso los vectores basados en HIV se han producido. Ya que los retrovirus de murine están bien caracterizados y los experimentos llevan consigo habitualmente modelos de ratón, los vectores utilizan el LTR de MoMLV, y la secuencia de ensamblaje (por ejemplo el N2. LNL6, y los vectores MFG). Aparte de las emisiones seguras que envuelven la generación de virus recombinates de tipo sin cultivar en la línea celular de ensamblaje analizada antes, para cualquier aplicación dada, muchos rasgos influencian la eficacia de un LTR. Algunos variantes de LTR han sido designadas especialmente para la expresión de ciertos tipos de células; por ejemplo, el vector basado en el virus de la célula de raíz embriónica de murine se expresa en células embriónicas. Los cambios en la LTR influencian la expresión, incluyen eliminaciones en la región U3 y señalan mutaciones que cambian la unión del factor de transcripción o unión de otras proteínas específicamente de la célula. El PBS inmediatamente adyacente al 5' también influye en la expresión; por ejemplo, un elemento silenciador de algunas células se une al emplazamiento de ARN de transferencia para la prolina pero no al ARN de transferencia para la glutamina.
La señal de ensamblaje generalmente usada es más extensa que la utilizada en los vectores de primera generación e incluye ahora N-terminal de gag que codifica secuencias. La expresión inicial del codón de iniciación para la síntesis de gag más el gen de interés puede ser prevenida por la mutación de la secuencia AUG o la inserción aguas abajo de un codón de terminación. Además , el codón de iniciación CUG de aguas arriba en MoMLV no está presente en MoMSV. Como consecuencia para las aplicaciones tales como el vector LNL6, se construye una secuencia de empaquetamiento híbrida que consiste en secuencias de MoMSV sin las secuencias CUG y MoMLV aguas arriba que contienen un AUG mutado.
Esta región también contiene el donador del empalme producido de forma natural aguas arriba del AUG del gag, el cual interactuaria con el aceptor del empalme aguas abajo de las secuencias que codifican el env. De todas formas, en ausencia del sitio aceptor de env, un sitio aceptor de un empalme críptico 3' en las secuencias que codifican el gag de la señal de empaquetamiento extendida es activada . El uso de la combinación del sitio aceptor-donador parece ser importante en algunos vectores (como el N2) pero no en otros (LNL6). Las secuencias víricas esenciales al final de 3' del vector viral incluyen las LTRs pero poco más .
En el proceso de designación de la unidad de transcripción de un vector de retrovirus, aparecen diversas preguntas. Primero, ¿es una proteína requerida o codificará el vector el gen de interés más un marcador seleccionable? Si se necesitan dos proteínas, ¿se usarán dos promotores o un ARN mensajero dicistrónico? Otra consideración importante es la cantidad de producto del gen requerida y la duración deseada de la expresión.
El LTR vírico se usa comúnmente como promotor e intesificador del gen de interés. Estos promotores son considerados como relativamente fuertes, y pueden dar grandes cantidades del producto génico . Si una línea celular específica es el objetivo, un promotor especialmente adaptado a esa línea celular será necesario, como se argumentó antes. Cuando dos genes son insertados, un segundo promotor es a menudo incluido aguas arriba de la segunda unidad de transcripción. Un estudio reciente sistemático comparó combinaciones y orientaciones distintas de los promotores de SV40 y CMV con betagalactosidasa y neomicina como los genes testados y se encontraron efectos marcados, lo cual variaba con la construcción precisa, en ambos, la expresión del gen y la estabilidad del vector. Un acercamiento alternativo es incorporar unos sitios internos de entrada para el ribosoma aguas arriba de la segunda región que codifica y contar con una transcripción sencilla para generar ambos productos génicos.
Una importante consideración para las aplicaciones que requieren una expresión a largo plazo es un promotor cerrado. Los experimentos indican que en algunos casos, el ADN vírico integrado persiste pero la transcripción se ve reducida a niveles indetectables. Este descubrimiento ha llevado a la búsqueda de promotores de mantenimiento de larga duración o promotores con gran especificidad tisular. También, cuando el producto es una proteína segregada, la investigación se ha dirigido a encontrar un tejido alternativo en el cual el gen pueda ser expresado pero el cierre pueda ser menos problemático.
Ya que muchos vectores están construidos por inserción de un ADN circular apropiado en un vector "cassette" preformado, la mayoría dependen de las señales de unión situadas en el extremodel vector. En el vector N2, por ejemplo, un donador de empalme y un aceptor están presentes en la secuencia extendiad de empaquetamiento. En el vector MFG, el aceptor de empalme es la secuencia que normalmente se utiliza en la producción de ARN mensajero de env. Localizando el AUG de la secuencia introducida que codifica precisamente en el lugar del AUG de env ha resultado una expresión altamente eficiente.
Aunque el diseño de vectores de retorvirus ha alcanzado un estado avanzado,es algo aún empírico. Este problema resulta en parte de la naturaleza de los retrovirus. Como el ácido nucleico del virus es ARN, los sitios de empalme crípticos presentes en cualquier genoma recombinado puede ser funcional y, en consecuencia, preludio del empaquetamiento de transcritos de largo metraje. El éxito sólo se puede asegurar testando el vector en células de embalaje apropiadas para determinar si se obtiene un alto título de virus, y si el vector es estable. Además, su capacidad para transducir células objetivo con alta eficiencia necesita ser ensayada.
Considerando ésto, de manera sorprendente pocos estudios sistemáticos se han hecho para comparar las propiedades de estos vectores . A menudo, lo que se construye, usado en estudios comparativos, difiere en más de un rasgo, haciendo difícil una interpretación. Una excepción, que puede ser interpretada , es el estudio sistemático de la expresión de beta-galactosidasa y de neomicín-resistencia en los vectores estrechamente relacionados mencionados antes. Un estudio más reciente examinó la expresión estable del ADA humano en células hematopoyéticas de ratón reconstituidas usando vectores MFG que contienen rasgos que influenciaban la expresión en otros contextos. Los resultados indican que los parámetros testados, el uso de una mutación PBS solamente o una LTR del virus del sarcoma mioproliferativo (MPSV), más que una LTR del MoML, producía expresión del gen significativamente mejorada.
Vectores Ad4 basados en la eliminación de E3 han sido diseñados par el uso como vacunas. En estos vectores, la unidad de transcripción que codificael inmunogén (por ejemplo el antígeno de superficie de la hepatitis B o el pg160 del HIV) se inserta en la región E3 del genoma de una cepa salvaje. Las pruebas en animales han sido satisfactorias, pero los resultados en test humanos han sido decepcionantes. Esto refleja probablemente la importancia de la región E3 en cuanto a que reduce la respuesta de inmunidad de la célula hospedadora al adenovirus. En su ausencia, la síntesis de antígenos dirigida al vector es de corta vida e incapaz de producir inmunidad.
Virtualmente todos los vectores adenovíricos para la terapia génica son vectores a los qwue se les ha sustituido E1, a los que les falta la mayoría de la región que codifica el E1 y crecen en células 293. Los vectores retienen inmediatamente es extremo terminal 5' inmediato del genoma viral, incluyendo las repeticiones terminales, secuencias requeridas para el empaquetamiento, y la superposición de la región incrementadora de E1.
Todas las secuencias que codifican para E1a son borradas, pero a menudo permanecen algunos de los extremos 3' del gen E1b y todas las proteínas de las secuencias que codifican las secuencias IX. Todos los restos del genoma vírico pueden ser dejados intactos, pero normalmente algunos o todas las secuencias que codifican la región E3 son también eliminados. Un informe describe un vector en el que E3 es retenido pero todas las secuencias en E4 eran eliminadas con la excepción de ORF-6, que era retenido porque parecía ser la única secuencia de la región E4 que es esencial para el crecimiento en el cultivo de tejido. El vector Ad2/ORF-6 se desarrolla bien, y es estable en células 293.
Los intentos para crear vectores basados en adenovirus con eliminaciones más extensas son limitadas por la capacidad de producir células de empaquetamiento apropiadas. En el presente, la eliminación de genes no esenciales,mutación condicional de otros genes, o la provisión de funciones del ayudante mediante la coinfección más que la expresión constitutiva son las opciones más simples. Un informe del así llamado vector pseudo-adenovirus (PDV) describía el desarrollo de un vector de base Ad2 que contenía solamente secuencias terminales repetidas virales 5' y 3' bordeando el ADN exógeno que codifica beta-galactosidasa. El desarrollo y empaquetamiento del vector en células 293 coinfectadas con un auxiliar de tipo salvaje es posible, pero la dificultad de quitar todo el virus auxiliar de tipo salvaje presentes, limita la aplicación práctica de tal vector. Otros informes recientes describen un vector E1- y E3- deleccionados en el cual el producto del gen E2a incluye una mutación sensible a la temperatura. Esta construcción fue producida con la esperanza de que al decrecer la actividad de la proteína de unión al ADN producida a 37ºC dejaría el resto de genoma vírico más quiescente.
Varios promotores se han usado par expresar genes exógenos en los vectores de adenovirus, incluyendo adenovirus MLP, PGK e híbridos CMV/beta-actina, así como el promotor endógeno E1a. La elección de un promotor adecuado depende de la aplicación y del tejido. El promotor cerrado como resultado de los vectores de adenovirus aún no han sido descritos.
Se han usado una variedad de señales para la poliadenilación, incluyendo la secuencia endógena E1b/proteína IX. Un problema que parece causar la baja producción de virus en algunos casos es la oclusión po cierre del promotor en la unidad de transcripción de la proteína IX, que es causada por la lectura a través de un fuerte promotor aguas arriba del gen introducido. La expresión de la proteína IX deja el empaquetamiento menos eficiente. Se puede resolver el problema aparentemente utilizando una fuerte señal de poliadenilación, tal como en SV40, aguas abajo del ADNc exógeno o invirtiendo la unidad de transcripción.
Las únicas secuencias esenciales para un vector AAV son los 145 nucleótidos TRs en el 5' y 3' al final del vector. Estos dan las secuencias necesarias para la replicación y el empaquetamiento del vector de ADN.
Para algunas aplicaciones, el tamaño del vector de ADN es problemático.El ADN es mayor de 4800 nucleótidos es difícil de replicar y empaquetar. Como consecuencia, la región promotor-incrementador y la señal de poliadenilación utilizada son seleccionadas algunas veces desde la base del tamaño mínimo requerido. Sin duda, un vector que codifica el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) utiliza un promotor sin el TR que no ha sido hasta ahora descrito.
Cuando el tamaño del ADN introducido no es problemático, se pueden utilizar unidades de transcripción más convencionales. Estas unidades pueden incluir varios promotores exógenos y, en algunos casos, marcadores seleccionables. Para introducir la especificidad de expresión en tejidos, también han sido introducidos segmentos de regiones de control del locus, pero con un éxito limitado.
Además del diseño y construcción de vectores HSV disminuidos la selección de promotores que resultarán en una expresión a largo plazo estable de un gen transducido en un tipo celular deseado es un área de investigación activa.
Hasta hoy los estudios se han centrado profundamente en la expresión del gen lac Z que ha sido situado bajo control de varios promotores celulares o virales con el propósito de definir aquellos elementos activos en cis suficientes para conferir una expresión genética neuronal duradera. Nuestro poco conocimiento de estos factores actuantes en cis y trans en el control de las expresión genética neuronal in vivo, junto con la posible inactivación de promotores heterólogos en el contexto del genoma vírico latente asociado a histonas nos ha llevado a las pruebas empíricas en un número elevado de elementos reguladores celulares y virales.
El sitio de inserción de promotores heterólogos del genoma de HSV y /o la proximidad de secuencias reguladoras del promotor lac pueden influenciar significativamente su actividad durante la latencia.
Desde que el virus codifica los LATs son transcritos indefinidamente durante la latencia neuronal, se han hecho considerables esfuerzos para definir aquellos elementos del promotor lac importantes en una expresión genética neuronal duradera, y para determinar si este promotor también puede ser usado para dirigir una expresión genética ajena. Se ha demostrado que la replicación competente de los vectores HSV es capaz de la expresión estable de la beta-globina y de la beta-galactosidasa en una proporción de neuronas sensoriales de murine cuando dichos genes son situados en diferentes localizaciones aguas abajo de la caja TATAque contiene el promotor LAT al que se le llama LAT1. Datos recientes han dilucidado la complejidad de la región reguladora del promotor LAT y han indicado que la expresión duradera sea facilitada por elementos contenidos en una segunda región promotora, llamada LAP2 , que se encuentra aguas abajo de LAP1 y tiene características comunes a los promotores de genes "housekeeper" eucariotas. Se ha vistoque el promotor LAP2 dirigen la expresión del gen lac Z en neuronas trigeminales durante 300 días después de la infección, independientemente de LAP1 cuando es insertado en una localización genómica ectópica. De este modo el aumento de la complejidad de la región promotora LAT de HSV ofrece considerables promesas como elemento suficiente para conferir una duradera expresión genética en neuronas in vivo y es importante determinar el nivel de expresión que puede alcanzar esta región promotora en diferentes tipos de neuronas desde que los primeros estudios se sugirió que la actividad de estos promotores en neuronas del sistema nervioso central es considerablemente menor que el observado en el sistema nervioso periférico.
Está claro que aunque vectores repartidores de genes HSV en etapas tempranas de su desarrollo, se han hecho progresos significantes respecto al desarrollo de replicaciones apatogénicas como en sistemas basados en amplicones. El mayor obstáculo que se ha de superar ahora y que, deja problemas con todo lo relacionado con el sistema de vectores es la expresión duradera. Así, aunque la expresión transitoria pueda ser alcanzada fácilmente por promotores bien caracterizados nuestro conocimiento de los requerimientos precisos que facilitan la expresión génicas estable es pobre y la influencia de factores como la organización de la cromatina, metilación y la estabilidad del ARN han de ser profundamente estudiados.
La producción de vectores basados en retrovirus en células empaquetadoras tiene tres objetivos, la producción de ácido nucleico del vector encapsidado en una partícula vírica con especificidad de infección, la producción eficiente de grandes cantidades de vectores, y evitar la salida de retrovirus replicativamente competentes (RCR).
Una línea de células empaquetadoras, se produce por medio de una transfección en el plásmido del virus auxiliar que codifique gag, pol, env y por la selección de células que expresen las proteínas y que soporte la producción de vector. Se puede evitar la replicación de las secuencias auxiliares haciendo al menos delecciones en las secuencias empaquetadoras. De forma similar, para evitar la recombinación con el vector en replicación se han de quitar secuencias adicionales. Por ejemplo, otras secuencias además de la secuencia que codifique la envoltura, incluyendo la LTR 3' , son comúnmente deleccionadas y sustituidas por una secuencia poliadenílica, como la del SV40. Las delecciones se pueden incorporar al LTR 5' para reducir su habilidad para replicarse y en su lugar se puede utilizar un promotor exógeno. Otras adaptaciones diseñadas para asegurar que la línea de células empaquetadoras no pueda producir RCR incluye la inserción de mutaciones puntuales o delecciones en posiciones claves del genoma del auxiliar y romper el genoma viral en dos unidades transcripcionales, uno que codifique gag y pol, y el otro que codifique env. La combinación de estos acercamientos y la transfección de células en diferentes tiempos para incitar a la integración del genoma dividido en diferentes sitios en el cromosoma de la célula hospedadora reduce la posibilidad de recombinación. A pesar de esto, la múltiple recombinación cruzada genera un estallido del vector de replicación-competente y queda la posibilidad de que deba ser constantemente testado para la producción en masa.
Para asegurar la especificidad apropiada del objetivo, el gen env del virus auxiliar/línea de célula empaquetadora puede ser variado. Por ejemplo,para generar un vector capaz de infectar células murina (también llamado vector ecotrópico), se puede usar en una línea de células de empaquetamiento que expresa una secuencia env desde un retrovirus murine como el MoMLV, pero para la producción de un virus capaz de infectar células humanas, en vez de este, se puede usar la secuencia env de un virus anfotrófico como el 4070A.
Recientemente, se ha llevado a cabo acercamientos más sofisticados del objetivo. Inicialmente, estas llevaban consigo la modificación covalente de viriones. Una aproximación más precisa consiste en quitar secuencias del gen env y reemplazarlas con secuencias que codifican proteínas con diferente especificidad. Por ejemplo, las secuencias erotropoyéticas se han utilizado para apuntar al receptor Epo. Otro acercamiento en incorporar un anticuerpo de cadena simple dentro de la secuencia env.
Un acercamiento diferente utiliza la capacidad del retrovirus para incorporar glicoproteínas de otros virus en su desarrollo para producir así los llamados pseudotipos. Métodos desarrollados de forma reciente incorporan la proteína HA del virus influenza y la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) como la glicoproteína de superficie de vectores retrovirus. La incorporación del VSV tiene dos consecuencias: primero, el vector tiene así un amplio campo de objetivo de la glicoproteína VSV; segundo, las partículas del virión parecen más estables y pueden ser concentradas por centrifugación sin pérdida de dosificación (título de una solución).
Para producir vectores de retrovirus, un vector dado en forma de plásmido es transferido en una línea de células de empaquetamiento seleccionada. Las secuencias del nuevo vector se integran y se replican bajo la influencia de las funciones del vector auxiliar endógeno, por eso generando viriones descendientes con la proteína de envoltura relevante provistas por la línea de cúlas de empaquetamiento. Típicamente, la producción de vectores en diversas líneas de células de productoras es examinada para encontrar un productor de alta estabilidad.
Mucho esfuerzo ha ido en desarrollo de líneas celulares de empaquetamiento debido a que la producción de virus debe ser reducida al máximo posible. Desde que este virus puede replicarse, su presencia en una población diferente incompleta o defectiva de retrovirus presentaría serios problemas de seguridad. Considerando las consecuencias de inyección de un vector auxiliador libre y un vector que contiene RCR en primates: los monos tratados con virus auxiliares libres permanecían con la enfermedad libres durante los períodos de observación, mientras que aquellos tratados con un vector que contiene RCR desarrolla linfomas después de pocos meses. Presumiblemente, el virus que replica es vertido o liberado constantemente e infecta células adicionales. La viremia resultante lleva a múltiples rondas de integración, eventualmente resultan en una acumulación de sucesos mutagénicos. El FDA requiere ser testado de forma rigurosa en lotes clínicos del vector si son de uso en humanos, y aunque raramente, estas salidas de RCR en lotes clínicos han ocurrido. La caracterización molecular del RCR muestra que regiones mínimas de secuencias de homología pueden dar lugar a recombinantes.
La capacidad para transducir objetivos celulares con retrovirus depende en parte de la multiplicidad de la infección, la cual depende del volumen y la concentración del virus añadido a las células. Idealmente, los vectores para uso clínico podrían ser purificados y concentrados, pero esto es díficil en la práctica porque las partículas de retrovirus son relativamente frágiles. Nuevos virus pseudotipo pueden ser una excepción, pero en el presente, lo mejor que pueden ser hecho es proteger la producción de células productoras de alta dosificación de virus. Además, para el uso humano, la línea de células para empaquetamiento debe ser testada rigurosamente para excluir la presencia de virus humanos y otros componentes.
Una línea celular (células 293), se usa generalmente casi de forma exclusiva para adenovirus. Estas células se producen por la transfección de ADN del Ad5 cortado en células del riñón del feto humano. Después de la selección y aprobación, la línea celular que resulta contiene cerca del 11% del genoma Ad5 desde el 5' y está inmortalizada, presumiblemente bajo la influencia de las funciones E1a y E1b. La duración exacta de la inserción de Ad5 y el número exacto de secuencias E1 de Ad5 es desconocido. Debido a que las células 293 contienen poco genoma de adenovirus (codifican, como mucho, una proteína estructural), su descripción como una línea de células de empaquetamiento es debatible. Quizás la línea de células auxiliares es más apropiada en este caso.
Justo como los retrovirus, la recombinación entre secuencias de E1 de Ad5 presentes en células 293 y las secuencias superpuestas en los vectores eliminados E1 en parte defectuosos, pueden generar adenovirus de replicación competente (RCA). Este problema se ha detectado en vectores basados en Ad2 de más longitud que el tipo sin cultivar, porque una vez presente, la progenie de replicación competente cubre rápidamente el vector introducido y porque el recombinante es un híbrido Ad5/Ad2 que puede ser distinguido de los tipos sin cultivar. Aunque menos fácil de detectar y caracterizar, la generación de RCA con vectores basados en Ad5 y en Ad2 más pequeños también ocurre. La frecuencia de esta recombinación es difícil de medir de forma segura. En el futuro, los investigadores intentarán minimizar secuencias que se superpongan con las secuencias de células 293. De forma similar, un desarrollo valioso sería una célula 293 de segunda generación con una región codificante E1 mejor definida, la cual podría ser dividida entre E1a y E1b (como con las células de empaquetamiento del retrovirus) para no fomentar la recombinación.
Aunque el RCA puede ser generado en la producción de vectores de adenovirus si son potencialmente peligrosos. Adenovirus de tipo sin cultivar pueden ser no fiables y la movilización y diseminación del vector por sí mismo no parece posible. Sin embargo, el requerimiento corriente de FDA para lotes clínicos de adenovirus es un RCA o menos por dosis.
Al contrario que retrovirus, los adenovirus permanecen estables cuando son sujetos a una purificación extensiva. Los procedimientos implican múltiples ciclos de congelación y descongelación para romper las células infectadas, y uno o más pasos de centrifugación seguido de diálisis o cromatografía. Las preparaciones purificadas del vector que contiene 10e12 partículas/ml, puede ser obtenido con facilidad. Así la magnitud del rango es mayor de lo que es posible en retrovirus y AAV .
Las preparaciones son testadas extensivamente para RCA y otros virus contaminantes. Además, las preparaciones deben encontrar un requerimiento de FDA de una partícula infectiva de unidad de radio menor que 100.
Los vectores AAV no tienen todas las secuencias que codifican virus, pero la línea de células de empaquetamiento no estable ya ha sido analizada. En consecuencia, los genes cap y rep deben ser introducidos en células como plásmidos al mismo tiempo que el plásmido del vector que contiene el ADN circular flanqueado por TR. Los métodos de transfección usados para este propósito son ineficientes y difíciles de cubrir. Además, las células transfectadas requieren una superinfección con adenovirus para dar funciones auxiliares adicionales. Los esfuerzos para mejorar la eficiencia de los métodos de producción son obstaculizados porque la proteína rep es tóxica para las células. Aunque se han considerado muchos métodos ingeniosos para solventar este problema, como fabricar un adenovirus auxiliar para expresar rep y cap, esto queda como un hecho significativo; ahora, los esfuerzos a gran escala para producir material para experimentos de animales y las pruebas clínicas implican la aplicación de la fuerza bruta de los métodos de transfección tradicional.
El auxiliar de adenovirus puede ser separado de los preparados de AAV por tratamiento de calor y/o por la centrifugación de CsCl para producir viriones purificados.
Una vez que se ha diseñado y producido un vector particular para una aplicación dada y se muestra que se puede producir en cantidades apropiadas, la próxima pregunta que aparece es, ¿funciona? ¿cuánto producto génico se sintetiza? ¿cuál es la duración de la expresión? Se pueden dirigir estas cuestiones usando células cultivadas.
El primer problema que necesita ser clasificado es si el virus transferirá el gen a las células deseadas. Para los vectores de retrovirus, este problema será determinado por una proteína que lo envuelve. Para los vectores basados en adenovirus, el conocimiento de la biología del virus no permite predecir si el vector entrerá en una célula particular o tejido, porque el tropismo conocido está definido en términos de capacidad del virus para replicarse en una célula. Un vector con éxito requiere sólo que el virus entre en una célula y exprese un gen exógeno. Además, el receptor de adenovirus no está bien caracterizado, de nuevo hacer una predicción es difícil. En la práctica los vectores de adenovirus pueden entrar en la célula de una amplia variedad de tejidos y especies. El rango del hospedador de AAV es difícil de predecir a partir de datos de infecciones víricas, porque el virus es defectuoso en cada caso. En la práctica, como con los adenovirus, los experimentos de transferencia de genes han demostrado que los vecotres son capaces de entrar en gran variedad de células.
Los marcadores seleccionables son comúnmente usados para ayudar en la identificación y enriquecimiento de células en las que un vector ha transferido el gen , especialmente con vectores basados en retrovirus y AAV. La selección para la resistencia a G418 en células tratadas con un vector que contiene un gen de resistencia a la neomicina es un modo poderoso de seleccionar células que posiblemente contengan el gen de interés adyacente.Aunque es de ayuda para estudios iniciales in vitro, este información no es necesaria para indicar el grado de transferencia del gen que esposible de alcanzar en ausencia de selección, excepto quizás en aquellas raras instancias donde la transferencia del gen terapéutico confiere por sí mismo una ventaja selectiva. La transferencia del ADNc de ADA a células T con pacientes deficientes en ADA es un ejemplo. Algunas generaciones posteriores de vectores retrovirus no tienen marcadores seleccionables aunque son muy eficientes, por ejemplo, los vectores basados en MFG en algunso vectores AAV, el gen terapéutico es tan grande como para impedir la inclusión de secuencias seleccionables.
Los métodos usados para detectar la transferencia y expresión del gen no deberían ser sólo cuantitativos , sino también indicar el porcentaje de células en las que el gen es transferido y expresado. Para detectar la transferencia del gen, el ácido nucleico puede ser examinado por métodos basados en Southern, Northern y PCR. El método de la PCR puedeser extremadamente sensible, pero la mayoría de las configuraciones no son cuantitativas. Ninguno de estos métodos mide el porcentaje de células para las cuales la transferencia ha ocurrido, pero se puede calibrar este valor usando los métodos in situ para detectar el ácido nucleico en la célula diana. El estado de integración del ácido nucleico del vector transferido es examinado a menudo. Se debe recordar que, ya que el comportamiento del virus tipo salvaje está bien caracterizado, un vector relacionado no se comportará necesariamente del mismo modo. Por ejemplo, en ausencia de rep los vectores AAV no siempre se integran, y si lo hacen, la integración puede no retener siempre la especificidad del tipo salvaje.
La detección del producto de la acción proteíca codificada por el vector se puede hacer por muchos métodos. La inmunocitoquímica es útil para las proteínas estructurales y no segregadas, aunque tengan una limitada sensibilidad para proteínas expresadas en pequeñas cantidades. Los métodos de inmunoprecipitación se usan algunas veces, pero dan pequeñas indicaciones de la distribución de la proteína. Las proteínas segregadas se detectan a menudo mediante test de ELISA y otros métodos basados en anticuerpos con gran sensibilidad. Algunos productos de la acción proteíca son detectados mediante ensayo de función, especialmente varios genes usados comúnmente para propósitos análíticos, por ejemplo, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa (CAT) y luciferasa. El colorante de la beta-galactosidasa es relativamente insensible y subgetiva a ser coloreada artifialmente en algunas células y tejidos, aunque la señal de localización nuclear para distinguir la actividad enzimática exógena evita este problema. Los ensayos con luciferasa y CAT son muy sensibles, pero no dan indicación de la distribución de la expresión génica.
Los ensayos para determinar la función de un gen terapéutico expresado es muy útil porque permite testar, por ejemplo, la complementación del efecto de un gen, o la inhibición del desarrollo vírico. La detección de la actividad de los canales para cloro del producto del gen CFTR , deriva de pacientes con fibrosis quística, es un buen ejemplo de este tipo de ensayo.
La interpretación de los datos obtenidos usando células en cultivo requiere precaución. Estas células se inmortalizan o se transforman o son de tejidos o especies inapropiadas. Más aún, sus propiedades de desarrollo, marcadores de superficie y receptores, el espectro de protooncogenes celulares expresados y supresores de tumor, e incluso su contenido de virus endógeno puede diferir de lo normal. Cada uno de estos factores podría influir en la unión, comprensión y expresión del vector. Además, los datos obtenidos en células cultivadas ignoran necesariamente la influencia potencial de las respuestas fisiológicas in vivo así como la respuesta inmune. Para mejorar algunos de estos problemas, se necesita tejido humano primario, pero estos cultivos son difíciles de obtener y desarrollar y tiene una duración de vida limitada.
El uso de células humanas ha sido particularmente útil en el estudio de la transferencia de genes por fibrosis quística. Por ejemplo, células epiteliales respiratorias primarias pueden ser desarrolladas en monocapa formando uniones estrechas, permitiendo así el ensayo de propiedades electrofisiológicas en cámaras Ussing. Un paso inmediato entre el cultivo de células y animales es el uso de xenoinjertos. Por ejemplo, la tráquea descarnada de rata puede ser poblada con células de los conductos aéreos humanos e reinjertada en ratones desnudos, permitiendo el estudio de la célula en monocapa durante algunas semanas.
Sin duda, los experimentos animales forman parte esencial del estudio de cualquier aplicaciones de terapia génica y se deberían iniciar lo antes posible. Estos experimentos tienen dos objetivos, el estudio de la seguridad del sistema de vectores y el estudio de la eficacia de la transferencia de genes.
Los estudios de seguridad se requieren por el FDA antes de que cualquier protocolo humano se permita. El efecto de la dosis y su duración es estudiado en varios animales, incluyendo primates y otros animales que sean hospedadores para el virus salvaje (por ejemplo, las ratas del algodón se usan para el estudio de adenovirus). La difusión de secuencias vitales, especialmente a las gónadas, es examinado y la replicación o expresión parcial de los supuestamente virus defectuosos también es testada. Cualquier defecto adverso como la inflamación tras la administración del vector es estudiada. El propósito de estos experimentos no es mostrar que el vector no tiene efectos adversos, ya que cualquier clase de droga tiene estas propiedades en algunas dosis. El objetivo es determinar el tipo de suceso adverso que podría esperarse si los humanos estuvieran expuestos al vector, y establecer las posibles dosis con la posible que estos efectos podrían ser predichos. Estos datos permiten la valoración de la posible proporción riesgo-beneficio de cualquier prueba potencial.
Los tests de eficacia requieren el desarrollo de modelos relevantes de estudio. Por ejemplo, para una enfermedad genética, un ratón con un gen eliminado o un animal con el fenotipo apropiado sería válido. Para aplicaciones en células hematopoyéticas se puede utilizar la repoblación de la médula en animales irradiados letalmente o tratados con drogas. El ratón eliminado no tiene algunas veces el fenotipo predicho; las células hematopoyéticas del ratón son más fácilmente manipuladas, seleccionadas, desarrolladas y transducidas con el vector que las células de primates y especialmente humanos y los modelos de cáncer en la vida real son impredecibles, a causa de la metástasis de los tumores humanos.
Las respuestas inmune e inflamatoria al vector viral o a la proteína exógena son importantes parámetros a estudiar. El uso de animales recién nacidos o ratones desnudos es valioso en los efectos que evaluan la administración de vector en ausencia de un sistema inmune completo funcionamiento. Además, la tendencia de los ratones que soportan mutaciones de eliminación de genes importantes en el sistema de inmunidad están disponibles así para que cualquier efecto pueda ser estudiado en detalle para probar el papel relativo de las diferentes armas del sistema inmune. Los ensayos sensibles están disponibles para detectar un gran espectro de citoquinas de ratón, agentes inflamatorios y marcadores celulares.
En la mayoría de los casos, los vectores retrovirus son aplicados ex vivo. Las células hematopoyéticas, epitiales o musculares son objetivos comunes. La transducción ha sido demostrada mediante el uso de células de múridos en cultivo, y la repoblación de animales se ha alcanzado usando varias moléculas de ADN circular. Por ejemplo, los investigadores han informado de la transducción de células hematopoyéticas con ADNc que codifica globina, glucocerebrósidasas y ADA; de fibroblastos con el factor IX; y de células musculares con el factor IX, hormona del desarrollo y ADA. Aunque inicialmente se detectan altos niveles de expresión, en algunos casos las expresiones disminuyen en un período de días a semanas. El análisis de células transferidas es entonces necesario. Demostrando la persistencia del ADN integrado en algunos casos, se ha establecido que la expresión que conduce el promotor del gen exógeno está cerrada . Estos resultados han llevado a la investigación de promotores más apropiados. Aparte de algunos éxitos, la expresión de larga duración , especialmente de grandes niveles de proteínas, como abundantes factores de coagulación de sangre, permanecen problemáticos. Además, las observaciones hechas u otras especies, especialmente primates (incluyendo humanos), pueden ser problemáticos.
Los sujetos humanos han sido tratados con células T autólogas que codifican ADA y con células de hígado transducidas ex vivo con el receptor de baja densidad de lipoproteínas .
En los dos últimos años, vectores de adenovirus que codifican marcadores beta-galactosidasa u otras proteínas han sido administrados a un número importante de tejidos en animales. De forma sorprendente, la expresión ha sido detectada en numerosos tejidos, incluidos pulmón, corazón, hígado, músculo, médula, cerebro, sistema nervioso central, células endoteliales, riñones, células de la retina y tumores sólidos. Los individuos con fibrosis quística han sido tratados con vectores adenovirus en la nariz y pulmón.
Los niveles de expresión en animales dependen de la cantidad de virus añadida y del vector usado, pero en general la expresión inicial es intensa , la duración de la expresión varía en gran manera. En ratones desnudos recién nacidos. la expresión es de larga duración, mientras que en ratones adultos la expresión decrece mucho en dos o tres semanas. La pérdida de expresión se asocia, particularmente en el hígado, con las infiltración de células inmunes e inflamatorias. Estudios anteriores con virus de tipo salvaje en ratones que no eran permisivos a la replicación vírica, mostraban dos fases de respuesta caracterizada por una infiltración inicial mediada por citoquinas de neutrófilos y monocitos, seguidos por una respuesta mediada por células T . El esfuerzo más corriente es focalizar en el intento de comprender los papeles relativos de los diferentes tipos de células en los procesos inflamatorios, resultantes de la administración de vectores adenovirus y la destrucción aparente de células tratadas con el vector. Una proposición es que los vectores defectuosos expresan aún cantidades significativas de proteínas víricas, las cuales son el objetivo de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), que en consecuencia eliminan las células que expresan el vector . La síntesis de proteínas de vectores defectuosos podría resultar de la expresión del gen que falla o de la complementación del desarrollo del vector en células diana por secuencias E1 integradas por funciones codificadas de la célula hospedadora con actividad parecida a E1, o por proteínass similares codificadas por otros virus. La hipótesis de destrucción de CPL, ocurre en contra de anteriores informes en que los adenovirus CTLs estaban restringidos, al menos en algunos haplotipos para las proteínas E1.
Cualquiera que sea el mecanismo en los ratones, las cuestiones reales son , ¿ocurren estos mecanismos en primates, especialemente humanos, y si es así, es posible erradicar los efectos? Por ejemplo, la expresión de la proteína del adenovirus E3 gp19 podrían reducir la respuesta de inmunidad del hospedador al vector debido a que esta reducción es una función normal en el ciclo de vida del virus de tipo salvaje. Otros acercamientos experimentales incluyen la incorporación de una mutación sensible a la temperatura en el gen E2 para que la proteína de unión al ADN desfavorezca la expresión del gen vírico. Otro acercamiento es la eliminación de parte de la región E4 para el mismo propósito.
Ya que el ADN del adenovirus raramente se integra, muchas aplicaciones de la terapia génica usando vectores de adenovirus requerirá una administración repetida. Los estudios de dosis repetidas revelan que los animales pueden volverse resistentes a múltiples administraciones y ala expresión del gen posterior. Este fenómeno varía con la dosis y el tipo de administración y es el sujeto de un intenso estudio. Para los procedimientos que conlleva la administración por vía de la corriente sanguínea, por ejemplo, al hígado, una explicación posible es el desarrollo de anticuerpos neutralizantes humorales. El objetivo de nuevo es comprender los mecanismos involucrados, así diseñar vectores mejorados capaces de evadir los mecanismos de vigilancia.
Un estudio cuidadoso de las respuestas inflamatorias e inmunes definirá para cada aplicación si existe una ventana terapéutica para el uso de los vectores de adenovirus en la cual la eficacia es evidente y sin toxicidad asociada. Esta definición esdifícil porque los resultados obtenidos en animales raramente predicen lo que ocurrirá en humanos. Sin duda, esta consideración ha impulsado el argumento para administrar vectores de terapia génica a humanos en lo que sería un estado muy temprano del desarrollo de la droga.
La propensión de algunos vectores de adenovirus a marcar células tratadas para la destrucción se puede usar para aventajar la destrucción de células cancerígenas. El uso de vectores suicidas que codifican agentes citotóxicos que a menudo producen efectos presentes junto con la respuesta inmune provocada en parte por el propio vector podría probar una aplicación efectiva de antitumores para los adenovirus.
Las dificultades en generar el vector AAV suficiente han impedido la disponibilidad de muchos datos animales. Los tratamientos ex vivo de fibroblastos y células hematopoyéticas resultaron en la expresión de genes de globina y el producto génico de la anemia de Fanconi. La aplicación in vivo da vectores para la tirosín hidroxilasa en el cerebro y vectores que codifican CFTR en conejos y monos que también han sido analizados. Hasta la fecha la expresión ha sido de larga duración, y los efectos contrarios de la administración del vector no han sido notificados. Mientras se llevan a cabo experimentos con dosis más altas necesitaremos establecer si los vectores AAV evitan alguno de los problemas inflamatorios y de inmunidad vistos con los vectores de adenovirus y si es así, ¿por qué?
(Ir a la segunda parte de este artículo)