UNIVERSIDAD DE GRANADA
FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA APLICADA I
4º CURSO DE BIOLOGÍA
MÓDULO DE GENÉTICA
TÉCNICAS MOLECULARES DE ANÁLISIS GENÉTICO
En este módulo de prácticas
se pretende familiarizar al alumno con el desarrollo teórico y práctico de
una de las técnicas de análisis del genoma rutinarias en cualquier laboratorio
de Genética molecular. Se trata de la clonación de
ADN que, junto con la técnica de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), constituyen dos procedimientos experimentales que
tienen como objetivo la amplificación de secuencias de ADN de un genoma concreto.
Se diferencian en que mientras una (la clonación) consiste en una amplificación
llevada a cabo in vivo y de una forma no específica (cualquier región
del genoma), la otra técnica (PCR) consiste en una amplificación in vitro
y de una forma muy específica (se amplifica una región muy concreta del genoma
de la cual se tiene información previa de su secuencia).
La clonación
de todos los fragmentos generados tras la digestión, con una enzima de
restricción, del ADN de una especie conduce a la creación de una genoteca
(colección de clones celulares cada uno de los cuales posee un fragmento de
ADN diferente del genoma de la especie objeto de estudio). La construcción
de una genoteca de ADN genómico pasa por una serie de pasos principales que
se detallan a continuación (ver Figura 1 para el caso
de clonación en un vector plasmídico):
2.
Introducción
de las moléculas de ADN recombinante en células hospedadoras apropiadas
3.
Selección
de células que han incorporado moléculas de ADN recombinante
1. Construcción de moléculas de ADN recombinante. El proceso de construcción
de moléculas de ADN recombinante depende del vector utilizado. Un vector adecuado
a nuestro experimento de clonación debe ser una molécula de ADN que cumpla
una serie de requisitos principales:
2. Que sea fácil de recuperar de la célula hospedador
3. Que su secuencia presente suficientes dianas para
enzimas de restricción diferentes
4. Que sea portadora de uno o varios marcadores seleccionables
Los vectores pueden ser plásmidos
(procarióticos o eucarióticos), el bacteriófago lambda, cósmidos (híbridos
entre plásmidos y fago lambda), cromosomas artificiales bacterianos (BACs),
cromosomas artificiales de levaduras (YACs) o cromosomas artificiales de mamíferos
(MACs),... Según el objetivo perseguido se utilizará uno u otro. Hay que destacar
que cada uno de los vectores mencionados tiene una capacidad diferente con
respecto al tamaño del fragmento de ADN que se puede insertar en él. Así,
los plásmidos admiten fragmentos de ADN de tamaño pequeño (menos de 10 Kilobases
–Kb-), el fago lambda admite fragmentos de unas 15 Kb, los cósmidos, de 45
Kb y los cromosomas artificiales de varios cientos de Kb. Por otro lado, hay
que mencionar que cada uno de estos vectores puede tener modificaciones con
distintos objetivos. Como ejemplo, mencionar la modificación que hace a un
plásmido un vector de expresión y que consiste en colocar secuencias promotoras
delante de los lugares de inserción de ADN extraño para permitir su expresión
en la célula hospedadora.
Utilizando como ejemplo el
caso de la utilización de plásmidos bacterianos, tenemos que proceder de la
siguiente forma. En primer lugar se digiere el ADN de la especie objeto de
estudio con una enzima de restricción adecuada. Si esta enzima genera extremos
de corte cohesivos, se utilizará la misma enzima de restricción para digerir
los plásmidos, dado que los extremos de ambas moléculas serán complementarios.
La enzima elegida ha de cortar una sola vez el plásmido (sólo debe existir
una diana para dicha enzima en su secuencia de bases). Si la enzima de restricción
genera extremos de corte romos, existen diversos procedimientos para favorecer
la unión entre vector y fragmento de ADN a clonar. A continuación, el plásmido
vector y los fragmentos de ADN a clonar se incuban en presencia de la enzima
ligasa que sellará la ligación entre ambas moléculas.
2. Introducción de
las moléculas de ADN recombinante en una célula hospedadora apropiada. De lo que se trata ahora es de hacer que los vectores recombinantes
se multipliquen en células hospedadoras adecuadas. Siguiendo con el ejemplo
de los plásmidos, éstos serían introducidos mediante un experimento de transformación
bacteriana.
3. Selección de células que han incorporado moléculas
de ADN recombinante. Una vez transformado un cultivo bacteriano hay que
seleccionar, entre las bacterias obtenidas, aquellas que poseen plásmido recombinante.
Hay que recordar aquí que el proceso se ha realizado de tal forma que nosotros
incubamos en un tubo de ensayo los plásmidos y los fragmentos de ADN del genoma
a estudiar y que, en presencia de ligasa, se pudieron originar ligaciones
que no siempre dan como resultado plásmidos recombinantes (por ejemplo, los
extremos cohesivos del plásmido pueden complementar entre ellos y cerrarse
el plásmido sin ADN inserto) y, por tanto, el resultado final de nuestra ligación
consiste en una mezcla de plásmidos recombinantes (con insertos de interés)
y plásmidos no recombinantes (sin inserto y, por tanto, sin interés para nosotros).
Tenemos que tener en cuenta, además, que esa mezcla es la que utilizamos para
transformar las bacterias y que en nuestro cultivo bacteriano, tras el experimento
de transformación convivirán 3 poblaciones de células: células no transformadas,
células transformadas con plásmidos no recombinantes y células transformadas
con plásmido recombinante (las únicas que nos interesan). Tenemos, pues, que
saber seleccionar las células de interés.
Esta selección se realizará
en placas conteniendo medio de cultivo sólido (la transformación fue llevada
a cabo en medio líquido). Para ello se hace una extensión del cultivo líquido
en la placa en las condiciones que nos permitan identificar bacterias con
plásmidos recombinantes. De esta forma, las bacterias de interés crecerán
formando colonias (clones bacterianos). Cada clon estará formado por bacterias
que tienen un plásmido recombinante con el mismo inserto (fragmento) de ADN
del genoma analizado.
El conjunto de todos los clones
(se supone que cada uno tendrá un fragmento distinto de ADN del genoma de
la especie analizada) constituye una genoteca. El rastreo (screening)
de la genoteca nos permitirá encontrar el clon de interés (que tiene el fragmento
del genoma que nos interesa estudiar).
Clonación
en el plásmido pUC18
El plásmido que vamos a utilizar es un plásmido artificial
derivado del plásmido pBR322. El plásmido pUC18 tiene un tamaño aproximado
de 2,7 Kb y en su secuencia destacan dos genes que actúan como marcadores
de selección (Figura 2). En primer lugar, un gen de
resistencia al antibiótico Ampicilina (gen AmpR) que confiere a
las bacterias que incorporan este plásmido resistencia a dicho antibiótico.
El otro gen es el gen lacZ. Este gen codifica para la enzima β-galactosidasa
que degrada la lactosa y otros β-galactósidos como el 5-Bromo-4-Cloro-3-Indol-β-D-galactósido
(X-gal). Sin embargo, esta copia del gen del plásmido pUC18 es defectuosa
en 3´ y, por tanto, el polipéptido producido tras la expresión de este gen
carece de actividad β-galactosidasa. Este plásmido se utiliza en experimentos
de clonación para transformar células DH5α de Escherichia coli.
Esta cepa de E. coli posee un gen lacZ defectuoso en 5´ aunque posee
un codón AUG interno que permite el inicio de la traducción del mensajero
lacZ, defectivo, en un polipéptido sin actividad β-galactosidasa. Cuando
una célula DH5α es transformada con el plásmido pUC18 (intacto), los
polipéptidos producidos por los dos genes lacZ defectuosos (el de la bacteria
y el del plásmido), que carecían de actividad β-galactosidasa por separado,
complementan (fenómeno conocido con el término complementación α) y la
célula ve restablecida la función β-galactosidasa. Sin embargo, la complementación
no ocurre si el plásmido introducido en la bacteria es un plásmido recombinante.
Ello es porque las diferentes dianas de inserción se localizan dentro del
gen lacZ en lo que se conoce como polylinker (región rica en diferentes
dianas de restricción únicas). Así, en un experimento de clonación, cualquier
inserto de ADN foráneo interrumpiría el gen lacZ del plásmido y la bacteria
con plásmido recombinante carecería de función β-galactosidasa como las
bacterias DH5α sin plásmido pUC18.
La presencia de los marcadores AmpR y lacZ
en el plásmido pUC18 permite seleccionar bacterias con plásmidos recombinantes
tras un experimento de clonación. Para ello, las células DH5α que han
pasado por una experiencia de transformación son sembradas en una placa con
medio de cultivo sólido (medio LB) que contiene Ampicilina y X-gal. El X-gal
es un β-galactósido degradado por la β-galactosidasa. Uno de los
productos de degradación del X-gal forma un precipitado de color azul sobre
las colonias bacterianas con función β-galactosidasa.
1. Las
bacterias no transformadas (carecen de plásmido pUC18 de cualquier tipo) no
crecerán en nuestra placa dado que son sensibles al antibiótico ampicilina
2.
Las
bacterias transformadas con plásmido no recombinante (sin inserto de ADN de
la especie que estamos estudiando) crecerán formando colonias de color azul
(dado que son resistentes a ampicilina y dado que tienen actividad β-galactosidasa
3.
Las
bacterias transformadas con plásmido recombinante (con inserto de ADN de la
especie que estamos estudiando) crecerán formando colonias de color blanco
(dado que son resistentes a ampicilina y dado que no tienen actividad β-galactosidasa)
En nuestro experimento vamos a obtener una genoteca
parcial del genoma de una especie de esturión (Acipenser naccarii).
Este experimento va a consistir en la clonación de sólo una parte del genoma
de esta especie. Una parte muy fácil de aislar del resto del genoma. Se trata
de una familia de ADN satélite. El ADN satélite está constituido por secuencias
cortas (en este caso, secuencias de 170 pares de bases –pb-) que se repiten
en tandem cientos de miles o millones de veces en un genoma. Estas secuencias
carecen de función codificadora y se acumulan en regiones determinadas de
los cromosomas del genoma de una especie. Concretamente, estas secuencias
constituyen la heterocromatina constitutiva que se acumula en los centrómeros
y telómeros, principalmente.
La base para el aislamiento
de estas secuencias reside en su elevado grado de repetición y en su disposición
en tandem. Así, cuando cortamos el ADN de una especie con una enzima de restricción
para la que existe diana en la unidad que se repite, dicha enzima generará
millones de fragmentos de ADN de tamaño igual al de una unidad repetitiva
(en el caso del esturión, fragmentos de 170 pb). Esos fragmentos de ADN tendrán
una movilidad electroforética idéntica en un gel de agarosa con lo cual se
acumularán en el mismo punto en el gel. Este cúmulo de fragmentos resaltará
sobre el rastro del resto de ADN genómico observado en el gel de electroforesis.
Así identificados los millones de copias de la unidad repetida (monómeros)
de nuestro ADN satélite, podemos escindir con un bisturí el trozo del gel
que los contiene, fundir la agarosa y purificarlos.
Una vez aislados y purificados
los millones de monómeros del ADN satélite, pasaríamos a clonarlos. Para ello,
se corta el plásmido pUC18, por ejemplo, con la misma enzima que generó los
monómeros del ADN satélite estudiado, se incuban plásmido y monómeros en presencia
de ligasa y la mezcla se utiliza para transformar células DH5α de E.
coli.
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