Coliformes. presunción

 Prueba presuntiva  para coliformes, coliformes fecales y E. coli

 Bacterias control:

 -control positivo; una cepa de E. coli que produzca gases a 45 grados

-control negativo: una cepa de Salmonella berta

 1- Seleccionar las diluciones 10^-1 a 10^-3

 2- Inocular con 1 ml de cada dilución (por quintuplicado) caldo lactosado (10 ml por tubo) que contiene una campana Durham.

Caldo lactosado para el  recuento de coliformes Los coliformes se definen como fermentadores de lactosa con producción de gases. El verde brillante y bilis incluidos en el medio inhiben el crecimiento de muchas bacterias. Se consideran positivos los tubos que presentan turbidez y tienen gases en la campana de Durham. Se cuenta el número de tubos positivos producidos por cada dilución y se compara con una tabla de NMP, que proporciona el NMP de bacterias en la muestra que proporciona esa combinación de tubos positivos y negativos en esa dilución

 3- Incubar a 35 º C durante 24 horas adicionales los tubos donde no se detectaron gases

Recuento presuntivo

4- Estimar el número mas probable de coliformes totales: contar el número de cultivos con gases en tres diluciones consecutivas y seguir las recomendaciones que se indican.

5- Iniciar la prueba de confirmación de coliformes

Coliformes: confirmativo

Prueba confirmativa de coliformes

Transferir “un asa” o una gota de cada tubo con gases de la prueba presuntiva a caldo BGLB, evitando en su caso la película superficial. Incubar los cultivos en  BGLB  a 35°C durante 48  h.

Recuento confirmativo

Calcular el NMP de coliformes utilizando la proporción de tubos con producción de gases confirmada de los tubos seleccionados en la  prueba presuntiva

confirmativa de coliformes fecales

a-prueba confirmativa de coliformes fecales

Los coliformes fecales se determinan a 45,5 ^oC  o menos frecuentemente a 44.5 °C.

1- transferir “un asa” o una gota de cada tubo con gases de la prueba presuntiva a un tubo de caldo EC

2- incubar a 24 h a 45.5 °C y detectar producción de gas. Si es negativo volver a determinarlo después de  48 h.

Recuento confirmativo

3-calcular el NMP de coliformes fecales

Confirmativa deE. coli

B/ prueba confirmativa de E. coli

1-agitar los tubos con gases en los cultivos en caldo EC. Sembrar en estrías una placa de L-EMB

 El medio de cultivo Levine EMB (“Eosin Methylen-blue Lactose Agar”) se emplea para el aislamiento e identificación de  dos enterobaterias (E. coli y  Enterobacter y para la identificación de un hongo (Candida albicans). Las colonias de E. coli aparecen de color gris metálico con un centro oscuro o incluso negro, mientras que las de Enterobacter aparecen sin el aspecto metalico y de color gris-marron

2-incubar  18-24 h a 35°C.

4-examinar las placas con colonias sospechosas de corresponder a E. coli : aplanadas oscuras, con o sin brillo metalico

5-transferir hasta 5 colonias sospechosas de cada placa en  L-EMB a tubos inclinados de  PCA

6-incubar durante 18-24 h at 35°C y emplear los tubos para la idntificación de E. coli. La identificación de una sola como de E. coli es suficiente para considerar el tubo con EC como positivo.

7-comprobar si  corresponden a E. coli:

7-1- Tincion de Gram- Todos los bacilos Gram negativos  deben ser :

a -sometidos a las pruebas del IMViC o utilizar API20E o el sistema automatizado “VITEK biochemical assay”

b-volver a cultivar en  LST para confirmar la producción de gas.

8-Interpretacion: 

Se consideran E. coli las bacterias de todos los cultivos que (a) fermentan la  lactosa con producción de gas en 48 h a 35°C, (b) son bacilos no esporulados Gram-negativos y (c) proporcionan un IMViC de ++-- (biotipo 1) o -+-- (biotipo 2).