Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR)
La
técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) es una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un
fragmento de ADN específico. Para llevar a cabo el experimento de amplificación
es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia del fragmento a
amplificar (un gen, una parte de un gen, una región no codificadora,...).
Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento de ADN y,
para ello, debemos realizar in vitro lo que hacen las células in vivo
para replicar su ADN.
Así, se trata de disponer en
un tubo de ensayo el ADN de la especie objeto de estudio. Además debemos añadir
en dicho tubo un par de oligonucleótidos que actúen como cebadores para la ADN
polimerasa. La elección de estos oligonucleótidos (cebadores o primers)
es crucial dado que han de delimitar la región a amplificar. En concreto, deben
ser complementarios a cada uno de los extremos 3´ de la región a amplificar:
En este esquema se dibuja en
la parte superior una molécula de ADN y se delimita
la región que ha de ser
amplificada (flechas verticales). En la parte inferior se destacan
los sitios de apareamiento
de los primers utilizados (flechas horizontales) y la
orientación de éstos.
Además del ADN y de los primers,
es necesario añadir al tubo de reacción los 4 tipos de desoxirribonucleótidos
trifosfatos (dNTPs) que componen el ADN (dATP, dGTP, dTTP y dCTP, en una mezcla
equimolar de cada uno de ellos). Por supuesto, añadiremos por último también la
ADN polimerasa que, en este caso, ha de ser una polimerasa especial capaz de
resistir las elevadas temperaturas a la que vamos a someter a nuestro tubo de
reacción. Dicha ADN polimerasa es la llamada Taq-polimerasa, aislada de la
bacteria Thermus aquaticus.
Una vez tenemos todos los componentes
en nuestro tubo de reacción (Figura 1), tenemos que favorecer
de alguna forma que ocurra la síntesis de ADN. Para ello, lo primero que debemos
hacer es facilitar la desnaturalización del ADN. A continuación, permitir el
alineamiento de los primers (apareamiento con su región complementaria)
y, por último, facilitar que la polimerasa lleve a cabo la síntesis de ADN utilizando
como cebadores los extremos 3´ de los primers utilizados. Así, nuestra
reacción constaría de 3 pasos:
1. Desnaturalización. Se conseguiría elevando la temperatura del tubo de
reacción hasta 94oC, durante, por ejemplo, un minuto (este tiempo
puede variar entre ½ minuto y 2
minutos)
2. Alineamiento. Se desciende la temperatura hasta una temperatura
que puede oscilar entre 40 oC y 60 oC (dependiendo de
diversos parámetros como la secuencia de los primers, su
especificidad,...). La duración de este paso puede oscilar entre ½ minuto y 2
minutos.
3. Extensión. Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los 72
oC y se deja actuar a la Taq polimerasa durante 1 ó 2 minutos.
Estos tres pasos constituyen un
ciclo. La repetición de este ciclo unas 40 veces, por ejemplo, permite obtener,
como resultado de un experimento de amplificación, millones de copias del
fragmento de interés.
Todo esto, por supuesto, se realiza
de forma automatizada. Para ello, los tubos de reacción se introducen en un
termociclador que de forma automática realiza los 40
ciclos de amplificación.
