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Esta práctica consta de dos partes:
1) Electroforesis en un gel de agarosa de los fragmentos generados por la
digestión de distintos enzimas de restricción (EcoRI, PvuII,
Dra I, SacI, HinfI y HindIII ) del ADN genómico de la dorada. Posteriormente
se realiza la transferencia del ADN a una membrana nylon mediante la técnica
de Southern-blot. Esta parte ha sido llevada a cabo en el laboratorio de Bioquímica.
Ahora, en el laboratorio de Genética:
2) Hibridación sobre la membrana con una sonda constituida por una
unidad monomérica de la familia de ADN satélite
EcoRI del centrómero de los espáridos
(clon pSa19). Para llevar a cabo la hibridación, se marca la sonda
mediante el sistema ECL Gold (Amersham). El marcaje consiste en conjugar la
sonda con moléculas de la enzima peroxidasa. Posteriormente, tras una
noche de incubación, se procede al lavado de la membrana y la detección
quimioluminiscente de la hibridación.
Se
procederá de la siguiente forma:
Primer
día: Marcaje de la sonda e Hibridación
1. Introducir la membrana en una botella de hibridación y realizar
una prehibridación durante una hora a 42°C con 10 ml de tampón
de hibridación (Tampón de hibridación ECL Gold; 0,5M
NaCl).
2. Transcurrido este tiempo añadir la sonda marcada directamente sobre el tampón de hibridación sin tocar la membrana. Poner en total 100 ng de sonda (10 ml de una solución de 10 ng/ml de sonda)Incubar toda la noche a 42ºC.
Durante
el periodo de la prehibridación , se procede a marcar
la sonda de la siguiente forma:
1. De una solución de sonda 10 ng/µl, pasar 10 µl a un microtubo eppendorf nuevo.
2. Desnaturalizar la sonda: introducir el microtubo en un baño a temperatura de ebullición. Mantener 10 minutos.
3. Pasar el microtubo a hielo durante 5 minutos.
4. Centrifugar 30 segundos.
5. Añadir 1 volumen de REACTIVO DE MARCAJE (complejo de peroxidasa cargado positivamente).
6. Añadir 1 volumen de solución de GLUTARALDEHIDO.
7. Agitar para mezclar y centrifugar 30 segundos.
8. Incubar a 37ºC durante 10 minutos exactos.
9.
Añadir la sonda marcada a la botella de hibridación.
LAVADO DE LA MEMBRANA
1. Pasar la membrana a una bandeja con 200 ml de la primera solución de lavado:
- 4 gramos de SDS
- 25 ml de 20xSSC
- Completar
hasta un litro con agua destilada.
2. Cubrir la membrana e incubar con agitación a 55ºC durante 10 minutos.
3. Repetir el lavado del paso 1 durante 10 minutos más con solución nueva.
4. Pasar la membrana a una bandeja nueva con 200 ml de 2xSSC.
5. Cubrir la membrana e incubar a temperatura ambiente y con agitación durante 5 minutos.
6. Repetir el lavado del paso 4 durante otros 5 minutos con 2xSSC de nuevo.
DETECCIÓN DE LA HIBRIDACIÓN
1. Mezclar 5 ml de REACTIVO DE DETECCION Nº1 (H2O2) con 5 ml de REACTIVO DE DETECCION Nº2 (Luminol).
2. Pasar la membrana a una bandeja limpia e incubar durante 1 minuto exacto con la solución de detección (a temperatura ambiente).
3. Pasar la membrana a un cassette de exposición de Rayos X entre dos plásticos y colocar en oscuridad una película HyperfilmTM ECL (Amersham) sobre ella.
4. Cerrar el cassette y esperar unos 30 minutos.
5. Transcurrido este tiempo, en oscuridad, revelar la película con revelador de fotografía (dilución 1/10) y fijar con fijador de fotografía (dilución 1/4).
6. Analizar los resultados.