La reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) es una técnica de amplificación de secuencias específicas de ADN in vitro. Esta técnica es básica y de uso casi cotidiano en el laboratorio de biología molecular, consiste en utilizar la capacidad de replicación del ADN para poder obtener copias de manera casi exponencial a partir de un fragmento específico de ADN. Lo que necesita la reacción es lo siguiente:

• Polimerasa: Esta enzima cataliza la reacción de polimerización de una cadena de ADN utilizando otra como molde, añadiendo nucleótidos libres en sentido 5' -> 3' y complementarios a la hebra molde, conformando un fragmento de ADN de doble cadena. Hay diversos tipos de polimerasa, siendo la más común la Taq-polimerasa.
• Cebadores: Pieza clave en la reacción, ya que serán el punto de anclaje de la polimerasa al ADN y determinarán el fragmento que se vaya a amplificar. Consisten en secuencias de unos 20 pbs que son complementarias a los extremos 5' del fragmento a amplificar. Se utilizan en pareja: uno para polimerizar la hebra + (forward) y otro para la hebra - (reverse). Al diseñarlos debe procurarse que se hibriden a la misma temperatura al ADN molde (normalmente unos 60º) y debe evitarse que puedan hibridar entre ellos.
• Desoxiribonucleótidos: Son los"ladrillos" de nuestro fragmento amplificado,hay que poner los suficientes para que no se agoten durante la reacción.
• Cloruro de Magnesio: Se utiliza como fuente de iones magnesio, cofactor de la polimerasa, depende de su concentración la eficiencia de la reacción será mayor o menor.
• Tampón de la polimerasa: Dilución de Tris-HCl con cloruro potásico para preservar el pH de la reacción, sin él la polimerasa no funcionará correctamente.
• Agua: La reacción debe ser llevada en disolución acuosa.
• DNA problema: necesario mínimo 10 ng de ADN.

Una vez mezclados los reactivos, la reacción se llevará a cabo en un termociclador, máquina utilizada para proporcionar los cambios rápidos y estables de temperatura necesarios para los ciclos de la reacción. La reacción se lleva pues en 3 ciclos principales:

• Desnaturalización inicial del DNA de doble cadena: se somete a 94º durante 1-5 min para romper los puentes hidrógeno que unen las dos hebras de ADN.
• Amplificación: esto consta de otros tres pasos que se repiten cíclicamente (unas 30-40 veces):
  • Desnaturalización: se mantienen las hebras separadas entre sí manteniendo entre 10-30 segundos a 94º la temperatura. Si es el segundo ciclo o más servirá para despegar los cebadores de las hebras de ADN.
  • Alineamiento: los cebadores se hibridan a la secuencia complementaria en el ADN problema, la temperatura de fusión (melting temperature) determinarán la temperatura óptima a la que el primer se hibridará. Este ciclo se mantiene entre 10-30 segundos.
  • Extensión: la polimerasa se ancla a duplex ADN-cebador, añadiendo nucleótidos en sentido 5'->3'. La temperatura óptima de la TaqPolimerasa es de 72º, y cada 10 segundos amplifica 100 pb, con lo que se juega con este tiempo dependiendo de la longitud del fragmento que esperamos obtener.
• Extensión final: se deja entre 5-10 minutos a 72º la reacción para que la polimerasa complete amplificados incompletos.

Esquema de la PCR

Tras estos pasos habremos obtenido 2ⁿ copias de la secuencia delimitada por los cebadores, donde n es el número de ciclos de amplificación programados en el experimento.