Enrique Iáñez Pareja
Instituto de Biotecnología
Universidad de Granada
2. Repaso de conceptos básicos
3. Creación y rastreo de genotecas
3.1 Rastreo por hibridación de ADN
La premisa de la I.G. es que la información genética codificada en el ADN es un recurso valioso que puede ser manipulado de varias maneras para lograr ciertos fines tanto en la ciencia pura como en la aplicada (producción microbiana de productos, plantas y animales transgénicos, nuevos diagnósticos).
Repasaremos algunos hitos históricos (ya conocidos por el estudiante) que influyeron en el nacimiento de la ingeniería genética:
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En 1953 se descubrió el fenómeno llamado de restricción: ciertos fagos (virus bacterianos) que parasitan a E. coli podían desarrollarse en ciertas cepas de esta bacteria, pero no podían hacerlo en otras (se dice que están “restringidos” en determinadas cepas). |
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A finales de los 60, Werner Arber, en Basilea, descubre las enzimas de restricción responsables de ese fenómeno: la cepa de bacteria restrictiva produce unas endonucleasas ("enzimas de restricción, o restrictasas") que escinden el ADN del fago crecido en otra cepa diferente. |
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Esas primeras enzimas de restricción eran inespecíficas en cuanto al sitio del ADN donde cortaban, pero en 1970 Hamilton Smith, en Baltimore, descubre un nuevo tipo de enzima de restricción totalmente específica: capaz de reconocer una determinada secuencia de ADN, de unos pocos pares de bases, y de cortar en ambas cadenas en lugares concretos. Las dianas de la mayoría de las restrictasas de este tipo son secuencias palindrómicas, es decir, "capicúas" (nota: la ´ señala el punto de corte). Ej: |
5'-G´GAACC-3'
3'-GGTTG´G-5'
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Muchas de estas restrictasas cortan en cada cadena en lugares separados del centro geométrico de la diana (como en el ejemplo anterior), de modo que generan extremos protuberantes |
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Los extremos protuberantes de distintos fragmentos de ADN generados con la misma restrictasa (incluso de fragmentos de especies distintas), tienen tendencia, al mezclarlos, a emparejarse entre sí por puentes de hidrógeno (siguiendo las reglas de emparejamiento A-T y G-C). |
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Si ahora añadimos la enzima ADN-ligasa a la mezcla de fragmentos de ADN de orígenes diferentes, se repararán los enlaces fosfodiésteres. Esto es lo que realizaron por primera vez Mertz y Davis en 1972 (Universidad de Stanford), y enseguida se dan cuenta de que ello podía constituir la base para la producción de moléculas recombinantes in vitro, con material genético de diferentes especies. |
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Pero este ADN recombinante, generado en el tubo de ensayo, es inerte, no es más que una macromolécula híbrida que por sí sola no hace nada. |
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Si queremos que el ADN recombinante haga algo, hay que introducirlo en células vivas que sean capaces de expresar su información genética. |
Esto nos lleva ya a la idea de lo que es la Ingeniería Genética: la formación in vitro de nuevas combinaciones de material genético, por medio de la inserción de un ADN de interés en un vehículo genético (vector), de modo que tras su introducción en un organismo huésped, el ADN híbrido (recombinante) se pueda multiplicar, propagar, y eventualmente expresarse.
Vamos a ilustrar el concepto de la ingeniería genética con el caso bastante fácil de lograr bacterias que hospeden nuevas combinaciones de ADN:
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Partimos de ADN que queremos aislar y estudiar: vamos a llamarlo ADN pasajero (ADN a clonar, inserto) | ||||||
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Por otro lado, necesitamos un vehículo genético para transportar y replicar ese ADN: lo llamamos vector. Los vectores son igualmente moléculas de ADN con capacidad de replicarse por sí mismos o de insertarse una vez que se introducen en el organismo adecuado. He aquí una lista de lo que debe poseer idealmente un vector genético:
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Finalmente, contamos con el organismo anfitrión o huésped. En los primeros tiempos de la ingeniería genética se manipulaban casi exclusivamente bacterias, pero hoy es posible modificar animales y plantas. La introducción del ADN desnudo en las células huésped se suele denominar como transformación. |
Así, pues, el “retrato robot” de un experimento de ingeniería genética podría ser como sigue:
El resultado del experimento es la obtención de al menos una colonia (clon) de bacterias que portan la combinación buscada de vector con el inserto de ADN pasajero. Se dice entonces que hemos clonado (=aislado) dicho ADN.
El primer experimento de este tipo lo realizaron en 1973 Stanley Cohen y Herbert Boyer en la Universidad de California. Se vio que era factible hacer toda clase de experimentos en los que se recombina ADN de organismos totalmente diferentes (bacterias, plantas, animales).
Se recomienda al alumno consultar sus apuntes o libros de pasados cursos para repasar una serie de conceptos que habremos de usar ampliamente:
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Enzimas de restricción con secuencia diana palindrómica
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Ligasa de ADN del fago T4: permite la unión covalente (por enlace fosfodiéster) de ADNs de orígenes diferentes previamente rotos con la misma enzima de restricción o con enzimas que generan el mismo tipo de extremos | ||||||||||||||||||||
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Uso de distintas enzimas de restricción para digerir ADN y generar mapas de restricción, empleando electroforesis en gel de agarosa y bromuro de etidio (que se visualizan bajo luz UV) | ||||||||||||||||||||
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Vectores de clonación en bacterias
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Métodos de introducción de ADN en bacterias en Ingeniería genética
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Sistemas químicos de manipular ADN
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En muchos programas biotecnológicos de nueva generación se pretende aislar algún gen que determine una proteína de interés. En muchos casos, para lograr esto se suele recurrir a la creación de una genoteca para rastrear luego en ella en busca de dicho gen.
Una genoteca (también llamada biblioteca génica) es una colección desordenada de clones de un microorganismo huésped en el que hemos introducido (con un vector adecuado) todo el genoma del organismo de interés en forma de trozos aleatorios. En teoría, una genoteca genómica debería representar el genoma completo en forma de un conjunto de fragmentos clonados parcialmente solapados, producidos de modo aleatorio y mantenidos de forma estable en la que no haya una mala representación de secuencias. Los pasos principales para producir una genoteca genómica son:
| El ADN genómico del organismo de interés se rompe en trozos aleatorios de tamaño medio adecuado a la capacidad del vector que luego vamos a usar. Es muy frecuente que para ello ese ADN se trate con una enzima de restricción que reconoce una diana de 4 pares de bases (pb), como la Sau3AI. Ahora bien, si dejáramos que dicha enzima digiriera totalmente el ADN, produciría por término medio un corte cada 256 pb, lo que rendiría trozos demasiado pequeños como para albergar genes completos (que suelen medir más de 1000 pb). Por lo tanto, lo que se hace es proceder a una digestión parcial del ADN con la enzima, controlando la dosis para que el tamaño medio de fragmentos esté dentro del margen que nosotros deseamos (p. ej., 10 kb). |
| Se recuperan los fragmentos aleatorios de ADN del rango de tamaños deseado |
| Se mezclan los fragmentos con un vector genético tratado con un enzima de restricción que produce extremos cohesivos del mismo tipo que los generados por la Sau3AI. Ahora se añade la ligasa de ADN, de modo que cada trozo de ADN del organismo de interés se liga covalentemente con una copia del vector. El resultado son miles de moléculas recombinantes, cada una consistente en el vector unido a un trozo diferente del ADN genómico original. |
| Dichas moléculas recombinantes se introducen (p. ej., por transformación) en un organismo o agente huésped: una bacteria como E. coli, fagos, etc. De este modo hemos logrado la genoteca genómica: disponemos de miles de clones independientes del huésped, cada clon con una molécula recombinante portadora de un trozo de ADN genómico del organismo de partida. |
Una vez disponible la genoteca, lo que nos queda es rastrearla en busca del clon o clones que porten el ADN con el gen o genes de interés. Esta operación, al igual que lo que ocurría con el screening de microorganismos para buscar sustancias útiles, puede ser más o menos fácil o directa, dependiendo de si disponemos o no de alguna estrategia racional de selección o de rastreo. Los métodos más frecuentes de identificación de clones recombinantes de interés en una genoteca son:
| Hibridación de ADN usando alguna sonda marcada |
| Rastreo inmunológico (uso de anticuerpos frente al producto de interés) |
| Rastreo o selección de la actividad biológica de la proteína |
Su fundamento estriba en la posibilidad de formación de ADN de cadena doble entre cadenas sencillas del ADN a sondear y cadenas sencillas de ADN marcado (ADN sonda). Un esquema de cómo se rastrea una genoteca sería como sigue:
| Los miles de colonias de una genoteca se replican a filtros de nylon o de nitrocelulosa situados sobre medio de cultivo sólido, y se incuban hasta que aparezcan las colonias de réplica. |
| Las células de las colonias se lisan in situ con un tratamiento suave |
| El ADN de las colonias se desnaturaliza (se convierte a cadenas sencillas) y se fija a los filtros mediante alta temperatura |
| Por otro lado, se ha preparado el ADN sonda marcado de alguna manera que luego sea fácil de detectar (véase más abajo) |
| El ADN sonda se desnaturaliza para convertirlo a cadenas sencillas |
| Ahora mezclamos el ADN sonda desnaturalizado y marcado con los filtros que contienen el ADN de la genoteca (igualmente desnaturalizado). Si el ADN sonda tiene cierto grado de homología con el ADN de alguno de los clones, se emparejará con dicho ADN para generar doble hélice. El ADN del resto de los clones no puede emparejarse con la sonda. En el lavado ulterior eliminamos el exceso de sonda, quedando sólo aquella sonda unida por dobles enlaces al ADN de los clones con los que tiene homología de secuencia. |
| Finalmente revelamos el resultado. Esto suele consistir en que encontraremos una mancha peculiar correspondiente a la colonia o colonias que hayan dado la hibridación con la sonda. Con esta información vamos a las placas matrices donde están las colonias originales de células vivas, y recuperaramos los clones, que podemos seguir estudiando. |
El ADN de la sonda se puede marcar de varias maneras, pero en general hay que disponer de un cebador, un corto fragmento de ADN que aporte extremos 3’-OH para la actuación de la ADN polimerasa. Últimamente se utiliza mucho la estrategia llamada de los cebadores aleatorios:
| El ADN que queremos convertir en sonda se desnaturaliza |
| Se le añade una mezcla con todas las secuencias posibles de 6 nucleótidos. Algunos de los hexanucleótidos encuentran su secuencia complementaria en el ADN de cadena sencilla de la sonda, y se emparejan con ella por puentes de hidrógeno |
| Ahora añadimos los 4 desoxirribonucleósido-trifosfatos (dNTPs), de los que uno está marcado, y la porción Klenow de la ADN-polimerasa I de Escherichia coli (este fragmento posee la actividad polimerasa 5’ à 3’, pero carece de la exonucleasa en 5’). Los extremos 3’-OH de los cebadores aleatorios suministran el sitio para que la Klenow comience la copia de la cadena molde, incorporando la marca portada por uno de los dNTPs. El resultado es que se sintetiza una cadena de ADN marcada. |
¿Qué tipos de marcado podemos usar?
| Se puede marcar el ADN mediante isótopos radiactivos. Uno de los dNTPs posee en su posición a un 32P. Obviamente, ese a-32P queda incorporado al esqueleto de ADN de la cadena copiada por la polimerasa. Cuando usamos una sonda de este tipo, y se une al ADN de una colonia, emite radiaciones. ¿Cómo las detectamos? Pues bien, una vez que se ha terminado la hibridación y se han lavado los filtros con el ADN, estos filtros se secan y se ponen en contacto con una película de rayos X (de radiografías). Al cabo de unas horas o de unos pocos días, la película se revela. Si en efecto ha habido hibridación, el resultado será que veremos, en alguna parte de la película revelada, unos puntos negros, que nos indican la posición de las colonias que contenían ADN homólogo con la sonda (autorradiografía). Como dijimos, ya solo nos queda volver a las placas de Petri originales y recuperar las correspondientes colonias para seguir el estudio con ellas. |
| Si no nos gusta manejar isótopos radiactivos, podemos recurrir a un procedimiento no radiactivo. Uno de los más populares consiste en marcar uno de los dNTPs con biotina y obtener la sonda. Dejamos que se produzca la hibridación. El revelado consiste en añadir estreptavidina acoplada a un enzima. La estreptavidina reconoce a la biotina, y el enzima es capaz de romper un sustrato incoloro generando una sustancia coloreada. Otras veces el enzima genera una sustancia quimioluminiscente que se puede detectar por autorradiografía. |
Ahora bien, ¿cuál es la fuente de la sonda? Lógicamente, el usar una sonda de ADN determinada se justifica porque sepamos o sospechemos que dicho ADN puede tener parecido con el ADN que estamos buscando en la genoteca. Los principales orígenes de las sondas moleculares son los siguientes:
| Una secuencia de ADN procedente de otro organismo y de la que tenemos indicios de que puede tener parecido con lo que estamos buscando. A este tipo de sondas se la suele denominar como sondas heterólogas. Cabe imaginar que el parecido no será completo. Por esta razón, a la hora de realizar la hibridación se escogen algunas condiciones más o menos relajadas, con objeto de que se puedan formar los heterodúplex a pesar de que la homología no sea del 100%, por lo tanto, que permitan cierto porcentaje de malos emparejamientos entre la sonda y el ADN diana. |
| Una sonda sintética elaborada a partir de la información disponible sobre secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente al gen que estamos buscando. Esto obviamente solo es posible si hemos purificado cierta cantidad de la proteína y hemos determinado al menos un porción de su secuencia. Con esta información, y utilizando el diccionario del código genético, podemos sintetizar todos los posibles oligonucleótidos sinónimos que codificarían dicha porción de proteína. Marcando esa mezcla de oligonucleótidos, los podemos usar como sonda para localizar el gen en una genoteca. |
Si no disponemos de una sonda de ADN, y si el gen que estamos buscando en la genoteca se expresa hasta nivel de proteína, podemos recurrir a un ensayo inmunológico (siempre y cuando, por supuesto, contemos con anticuerpos frente a la proteína en cuestión). Sus primeras fases son parecidas a las de la hibridación in situ que hemos descrito arriba:
| Se hacen réplicas de todas las colonias de la genoteca a filtros de nylon o nitrocelulosa depositados sobre la superficie de medio sólido |
| Las colonias de réplica se lisan in situ, y las proteínas liberadas se fijan al filtro |
| El filtro con las proteínas unidas se trata con anticuerpo específico que reconoce la proteína que estamos buscando (anticuerpo primario, que no está marcado) |
| Lavamos para quitarnos los productos en exceso y no unidos |
| Ahora tratamos el filtro con un segundo anticuerpo. Este anticuerpo secundario reconoce al anticuerpo primario, y lleva unida una enzima como la fosfatasa alcalina. |
| Una vez que volvemos a lavar, se añade un sustrato incoloro sobre el que actúa la enzima ligada al segundo anticuerpo, de modo que libera un producto coloreado. El resultado, pues, es que allí donde hubiera proteína reconocida por el anticuerpo primario, se formará una manchita de color debida al producto generado por la enzima unida al anticuerpo secundario. |
| Volvemos a las placas originales, localizamos la colonia que ha dado positivo, y la estudiamos en detalle para confirmar que lleva el gen de interés. |
Esta estrategia se puede aplicar cuando lo que estamos buscando es un gen que determina una actividad que no está presente en el microorganismo huésped original donde hemos albergado la genoteca. Algunos ejemplos:
| Imaginemos que hemos creado en Escherichia coli una genoteca genómica de un organismo productor de a-amilasa, o de endoglucanasa, o de b-glucosidasa (E. coli no produce por sí mismo ninguna de estas enzimas). Pues bien, una genoteca completa se puede rastrear fácilmente para estas actividades enzimáticas replicándola en un medio con los sustratos adecuados, y viendo a simple vista el halo correspondiente a la degradación de esos sustratos. |
| Si
estamos buscando genes relacionados con biosíntesis de algún aminoácido o
base nitrogeneda, lo que hacemos es una genoteca en un organismo huésped
auxotrofo para ese metabolito, y la sembramos directamente en medio mínimo,
de modo que solo crecerán aquellos clones que lleven insertos de ADN que
codifiquen la enzima biosintética que le falta al huésped, generando el
fenotipo prototrofo.
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Última actualización: martes, 15 de febrero de 2005
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