Enrique Iáñez Pareja
Instituto de Biotecnología
Universidad de Granada
2. Ejemplos de ingeniería metabólica tradicional
2.1 Reducción de acetato en E. coli para lograr gran producción de proteínas recombinantes
2.2 Ingeniería metabólica en bacterias del ácido láctico
3. Ingeniería metabólica genómica y sus aplicaciones
3.2 Análisis de flujo metabólico
3.3 Ejemplos de aplicaciones de análisis de balance de flujo
Definición de ingeniería metabólica:
 | Manipulación de los procesos metabólicos mediante tecnología recombinante con el objetivo de mejorar las propiedades de los microorganismos. |
| Mejora dirigida de las propiedades celulares mediante I.G. para modificar o introducir nuevas reacciones bioquímicas específicas. |
| Alteración racional y dirigida de las rutas metabólicas de un organismo para mejor comprender y utilizar las rutas celulares en transformaciones (conversiones), transducción de energía y ensamblaje supramolecular. |
Es un campo interdisciplinario que usa principios y técnicas de varios ámbitos: ciencias computacionales, genética, bioquímica, ciencia de los sistemas, biología celular y molecular, ingeniería bioquímica. El interés estriba en redirigir los flujos metabólicos para objetivos industriales y médicos.
| Incrementar productividad del proceso (ej., producción de antibióticos) |
| Incrementar la producción de precursores biosintéticos o polímeros |
| Ampliar capacidades metabólicas añadiendo actividades extrínsecas. |
Hasta hace poco, esto se hacía de modo empírico, por ensayo y error (rondas sucesivas de mutagénesis y rastreo o selección de mutantes).
El problema técnico de la acumulación de acetato en cultivos densos de E. coli en los biorreactores, que tiene efectos negativos sobre la producción de proteínas recombinantes.
| Una aproximación obvia es la destrucción o eliminación de la porción de la ruta que conduce desde el nodo de acetil-CoA a la formación de acetato. |
| Otro enfoque es un mejor control de la captación de fuente de C para reducir la acumulación de piruvato o acetil-CoA |
| Creación de una nueva ruta que encaje en las rutas glucolíticas preexistentes introduciendo genes que codifiquen enzimas apropiadas. |
Dos enfoques usados para modular la captación de glucosa:
| Metil-a-glucósido (MG), un análogo de la glucosa que entra por el mismo sistema PTS, no tóxico, metabólicamente inerte, inhibidor competitivo de la E-IIglc. La adición de MG redujo la acumulación de acetato en el fermentador. |
| Basándose en estos estudios, se construyó una raza manipulada que tenía baja formación de acetato a través de la modificación de la tasa de captación de glucosa. La cepa tenía una mutación en el gen ptsG, que codifica la PEP:PTS. La producción de proteína recombinante aumentó 50% |
Redirección del flujo de C hacia subproductos menos inhibitorios: expresión heteróloga del gen de la acetolactato sintasa (ALS) de B. subtilis, cuyo producto convierte piruvato en acetoína. Se escogió el punto de ramificación del piruvato debido a su posición central de punto de redirección de flujo. La expresión heteróloga de ALS modificó drásticamente los flujos glucolíticos: el nivel de acetato excretado se redujo drásticamente, siempre por debajo de su nivel tóxico, mientras que la acetoína es 50 veces menos tóxica. No se afectaron la tasa de crecimiento específica ni los rendimientos celulares.
Eliminación de enzimas críticas implicadas directamente en la formación de acetato, específicamente la ruta acetato quinasa-fosfotransacetilasa (ack-pta). La destrucción de esta ruta originó bajos niveles de acetato a expensas de la aptitud celular, debido a que la ruta de la LDH a partir del piruvato se hace mucho más competitiva.
Las BAL homofermentativas tienen un metabolismos relativamente sencillo enfocado a la rápida conversión de azúcar en láctico, y carente de muchas capacidades biosintéticas. Poseen un elaborado sistema proteolítico centrado en la rotura completa de proteínas en aminoácidos, que son captados u usados en biosíntesis. No hay casi solapamiento entre el catabolismo del C y el metabolismo biosintético del N, lo que las hace objetivos ideales de la ingeniería metabólica: cada metabolismo puede ser modificado sustancialmente sin influir en el otro en la medida en que no se altere la generación de energía ni la biosíntesis de material celular.
El metabolismos homofermentativo se caracteriza por altas tasas metabólicas, logradas principalmente por la muy alta actividad de LDH, que regenera NAD. Ha sido muy fácil redirigir los flujos metabólicos hacia la producción de otros metabolitos.
Se sabe que ciertas condiciones se reduce la formación de láctico y aumenta la de ciertas sustancias, algunas de las cuales (acético, fórmico, acetoína, acetaldehido, diacetilo) contribuyen a las cualidades organolépeticas de las leches fermentadas:
| Poco metabolismo de azúcar, con sustratos como galactosa o limitación de azúcar |
| Alta aireación |
Estas condiciones provocan una baja actividad LDH o bajos niveles de NADH.
| En Lactococcus lactis el gen ldh se inactivó por integración de plásmido. La cepa mutante tenía una fermentación mixta en anaerobiosis, produciendo acético, fórmico, acetoína y etanol, y una fermentación casi homoacetoínica en aerobiosis. |
| Algo parecido en Lactobacillus plantarum, aunque fue más complicado porque esta bacteria posee dos LDH (para D- y L-láctico) |
En ambas bacterias la producción de etanol se mejoró más clonando los genes de Zymomonas mobilis, una bacteria muy eficiente en formación de etanol: la clonación de los genes pdc-adh (piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa) en los mutantes ldh con LDH inactivada originó un 2% de etanol.
Superexpresión de NADH-oxidasa (NOX). Se clonó el gen nox de Streptococcus mutans bajo el control del promotor de nisA inducible por nisina en L. lactis, y la adición de cantidades subhinibitorias de nisina.
El aroma a mantequilla se debe al diacetilo, aunque se produce en pequeñas cantidades de modo natural. Hay un intermediario inestable, el a-acetolactato, que normalmente se convierte en acetoína (acetotolactato descarboxilasa, producto del gen ALDB). Se realizó un doble cambio: superexpresión del gen NOX (para bajar nivles de LSD) y disrupción integrativa del gene ALDB. La cepa resultante convertía más del 50% del azúcar en diacetilo. Esto es un buen ejemplo de cómo convertir BAL en factorías de compuestos para alimentación.
Superexpresión de alanina deshidrogenasa de Bacillus sphaericus en L. lactis originó la producción de alanina dependiente de amonio a partir de azúcar. Cuando la clonación se hizo en un mutante ldh el resultado fue espectacular: más del 99,5% del azúcar se convirtió en alanina. Si además se deleciona el gen de la alanina racemasa, se puede lograr convertir a esta bacteria en fábrica de L-alanina, que se usa como potenciador del sabor.
Con la llegada de la I.G., se abre la perspectiva de hacerlo racionalmente y a voluntad, realizando cambios específicos en el genotipo que rindan fenotipos superiores previstos de antemano. Sin embargo, como dice Stephanopoulos, “existía una gran disparidad entre el poder de las herramientas genéticas actuales y la capacidad para analizar racionalmente las redes bioquímicas”. Desde comienzos de los años 90 toma cuerpo el nuevo enfoque de rediseño metabólico racional, estimulado por las aplicaciones comerciales potenciales y por el atractivo de sustituir procedimientos químicos por otros equivalentes biológicos.
El acercamiento ingenieril al análisis y diseño depende de tener un modelo matemático o computacional (simulador dinámico) del metabolismo, en la esperanza de que tal modelo se pueda usar luego en el diseño sistemático, por I.G., para lograr los cambios deseados. Tras los comienzos en los años 60, se llega en los 90 a la teoría de los sistemas bioquímicos (BST) y al análisis del control metabólico (MCA). Ambos métodos proporcionan cálculos sobre cómo los cambios en la concentración o en la actividad enzimática pueden llevar a cambios en los flujos metabólicos y en las concentraciones de metabolitos. Se ha visto que cambios sutiles en actividad de enzimas pueden lograr grandes cambios en los flujos. Igualmente se ha visto que las limitaciones de los flujos no suelen deberse a una sola enzima, lo que sugiere que las modificaciones genéticas deben ser amplias, incluso afectando a todos los genes de una ruta.
El deseo de tener modelos detallados dinámicos (cinéticos) del metabolismo elucidando el comportamiento sistémico de las redes metabólicas comienza a ser factible en la era postgenómica. Ahora tenemos la perspectiva de elaborar catálogos de partes de los componentes del metabolismo en razas concretas. A partir de esa información es posible reconstruir redes metabólicas a escala celular y recabar información sobre la estructura y estequiometría de la red y de sus reacciones. Se pueden pues construir modelos metabólicos a escala genómica.
La fisiología de las redes complejas como el metabolismo es una función de múltiples componentes que interaccionan. Por lo tanto, para comprender la función del metabolismo en tanto ligado a la fisiología celular global se necesita un enfoque holístico del estudio del metabolismo. Esa comprensión de la función sistémica de una red metabólica es obligatoria para el éxito del campo de la ingeniería metabólica.
El control del flujo metabólico es el objetivo primario de la ingeniería metabólica. El flujo metabólico se define como la tasa a la que el material se convierte vía reacciones y rutas metabólicas. Para ello debemos comprender los factores que influyen en el flujo. Una vez que uno entiende el flujo metabólico, se ha dado un paso hacia la comprensión del metabolismo celular, con lo que el ingeniero está en posición de alterar el genotipo de la célula en la esperanza de lograr el fenotipo deseado.
Objetivos:
Aumentar la producción de metabolitos demasiado caros de obtener por síntesis química o para introducir una nueva capacidad.
Organismos con nuevas capacidades catabólicas, de gran interés en aplicaciones ambientales o en microorganismos industriales que puedan crecer usando sustratos diferentes y más baratos para la obtención de vitaminas, aminoácidos, antibióticos, etc.
Propiedades celulares que sean beneficiosas en el proceso industrial: evitación de productos tóxicos como el acetato y desvío hacia productos menos tóxicos (etanol, acetolactato). Escherichia coli con compuestos portadores de oxígeno, lo que le permite mejorar en condiciones de limitación de oxígeno.
La ingeniería metabólica ya se hacía, pero se han logrado resultados inesperados cuando las enzimas se sobreexpresan o se reprimen. Lo impredecible de la respuesta metabólica a las alteraciones genéticas se debe a la naturaleza multigénica de la función metabólica. Por lo tanto, no basta entender la función de una enzima o de una ruta aislada para describir la respuesta holística del sistema al cambio genético. Por lo tanto, para que la ingeniería metabólica se beneficie de la I.G. hace falta comprender las funciones multigénicas, y para ello necesitamos la genómica.
Tras terminar un proyecto genoma, hay que identificar los genes o las ORFs, mediante:
| Búsqueda por contenido |
| Búsqueda por señales |
| Métodos integrados |
Estamos a punto de obtener catálogos completos de componentes de muchos organismos. La genómica funcional debe llevar al uso de esa información para analizar interpretar y predecir las funciones celulares resultantes de su actividad coordinada. La acción coordinada de múltiples genes y proteínas se puede considerar como un “circuito genético”, que es el conjunto de diferentes productos génicos que se requieren conjuntamente para ejecutar una función particular. Para comprender la naturaleza sistémica de las funciones celulares, cada gen debe estudiarse en relación con su contribución a la función celular global.
Actualmente los microorganismos suministran los mejores modelos para establecer métodos in silico para analizar, interpretar u predicir las relaciones genotipo-fenotipo. Una vez que se han completado las asignaciones de ORFs a genes metabólicos, se puede construir el mapa metabólico completo que representa la estequiometría de todas las reacciones metabólicas que tienen lugar en la célula.
Con el subconjunto de genes que codifican las enzimas metabólicas se puede construir una red de reacciones metabólicas. Se puede escribir un balance de flujo para cada metabolito, y con el tiempo, en el estado estacionario, los flujos se deben equilibrar para evitar una acumulación significativa del metabolito en la red. La estequiometría de todas las reacciones de la red se puede representar por una matriz estequiométrica
S·v = 0
| S
es la matriz estequiométrica de m x n
| ||||
| v es el vector de n flujos metabólicos |
Típicamente el sistema está indeterminado donde m>n. Pero bajo ciertas condiciones algunas rutas no son operativas y se pueden obviar. El sistema se puede hacer totalmente determinado o supradeterminado y se puede resolver junto con las medidas de los flujos externos o internos. Los métodos no invasivos de análisis, como la RMN pueden proporcionar también información sobre la estructura de la red.
Para determinar el estado metabólico hay que resolver esa ecuación para los flujos metabólicos (v), lo que entonces indicará el estado metabólico de la célula bajo las condiciones definidas. La matriz S es el componente clave del análisis de flujo, y se puede derivar de la información genómica.
El sistema indeterminado origina un rango infinito de soluciones a la ecuación, pero las reales residen en un subconjunto llamado el set factible. Este se puede definir como las capacidades del genotipo metabólico de un organismo, puesto que define todas las distribuciones de flujo que se pueden lograr con un juego particular de genes metabólicos. El uso particular del genotipo metabólico bajo unas condiciones concretas se puede definir como fenotipo metabólico desplegado en esas condiciones.
Resumiendo lo visto hasta ahora: la genómica nos suministra información sobre la estructura y contenido de la red metabólica de un organismo. A su vez, esto nos sirve para generar una matriz estequiométrica, definida por la asignación de las ORFs. Entonces, el análisis de balance flujo se puede emplear para explorar la capacidades teóricas de producción y aptitud general del genotipo metabólico.
Ejemplos de objetivos:
| Eliminación de una enzima o su inhibición para eliminar una ruta que compite con la de interés |
| Eliminación de un subproducto tóxico |
| Amplificación de un gen o grupo de genes para mejorar la síntesis de un producto existente |
| Expresión de enzimas heterólogas para para extender el rango de sustratos, para producur una nueva sustancia, para lograr rutas de degradación de compuestos tóxicos |
| Desregulación de enzimas para relajar los mecanismos de control de un nodo rígido |
| Manipulación adicional de una ruta del metabolismo central para generar precursores, cofactores y energía necesarios para sostener a la ruta de interés modificada |
Veamos algunas áreas de aplicación.
El análisis de balance de flujo se puede emplear para interpretar y predecir los efectos fenotípicos de alteraciones en el genotipo, como las debidas a deleciones. Se puede hacer una predicción sobre si la deleción va a alterar negativamente la tasa de crecimiento o no va a tener influencia. La incapacidad de la red de absorber una alteración conduce inmediatamente a la requerimientos auxotróficos. Con ello podemos determinar los requerimientos auxotróficos que se necesitan en una cepa genéticamente alterada para encaminar los recursos metabólicos hacia rutas o reacciones particulares.
En un estudio in silico se investigó la relación entre el genotipo metabólico de cepas K.O. de E. coli y su fenotipo, recurriendo a todas las combinaciones posibles de deleciones sencillas, dobles y triples de los genes del metabolismo intermediario. Los productos génicos se clasificaron en varias categorías: esenciales, importantes, no esenciales y redundantes. Un buen número de genes parecían redundantes para el crecimiento en medio mínimo con glucosa. Los fenotipos previstos eran coherentes con los mutantes caracterizados experimentalmente.
Se puede investigar los cambios esperados en el enrutamiento metabólico cuando hay pérdida de función de un producto génico por deleciones génicas o por inhibición de su actividad. La red metabólica tiene la suficiente flexibilidad estequiométrica para redistribuir sus flujos metabólicos con pocos cambios en su capacidad para el aumento de biomasa, incluso cuando se pierden enzimas clave. Además, el análisis de flujo se puede usar para predecir los fenotipos metabólicos bajo difererentes condiciones de crecimiento, como sustrato o disponibilidad de oxígeno.
El análisis de flujo se puede combinar con técnicas recientes que examinan la expresión genética en una escala genómica. Aunque la relación entre el valor de flujo y los niveles de expresión génica es no linear, se puede obtener información cualitativa (on/off), así como la importancia relativa de los productos génicos bajo una determinada condición. Basándose en la magnitud de los flujos metabólicos, se pueden inferir evaluaciones cualitativas de la expresión génica. Estos se puede comparar con grupos de datos experimentales (arrays de oligonucleótidos). Ello se vio con la levadura: se observaron los cambios temporales en los perfiles de expresión génica durante el cambio diaúxico usando ESTs de todo el genoma.
Un modelo estequiométrico con este hongo consideró 61 flujos internos y la captación de glucosa, lactato, g-butirato y 21 aminoácidos. Puesto que se consideraron 49 metabolitos intracelulares y 82 flujos incluyendo tasas de captación, el número de grados de libertad fue 33. Se midieron 33 flujos, el mismo número que el de grados de libertad, incluyendo las tasas de captación de los sustratos mencionados y las tasas de formación de penicilina V y de 5 otros intermediarios clave. Se calculó el rendimiento máximo teórico de producción de penicilina para dos rutas diferentes de biosíntesis de cisteína, una por sulhidrilación directa y otra por transulfuración. El estudio propuso que un incremento de 20% del rendimiento teórico máximo de penicilina V sobre glucosa era posible si la cisteína se sintetizaba por sulfhidrilación directa en lugar de por transulfuración.
Las herramientas genéticas ideales para la ingeniería metabólica deberían ser:
| Promotores fuertes y con un control estricto y consistente en todas las células. Los promotores inducibles deberían responder de modo lineal a la cantidad de inductor |
| El sistema de control genético debería poder regular la expresión simultánea de múltiples genes aunque a diferentes niveles |
| El vector debería mantenerse indefinidamente en el huésped en ausencia de una gran presión selectiva |
| El vector y el sistema genético de regulación asociado deberían imponer el mínimo de carga metabólica en ausencia de expresión génica |
(Véase artículo para ampliar estas ideas)
| Deberían tener estabilidad segregacional, al estilo de la que tienen los plásmidos F y P1 |
| Deberían tener un número mínimo pero consistente de copias en todas las células del cultivo. La consistencia la logran plásmidos como el F, cuya replicación está coordinada con el ciclo celular |
| El vector debe poder albergar grandes fragmentos de ADN para poder clonar rutas completas. De nuevo parece que los sistemas mejores son los derivados del plásmido F |
| Encotrar vectores de amplio espectro de huéspedes |
Se han diseñado vectores basados en el plásmido F. Tienen entre 1-5 copias por célula. Se ha construido un vector derivado de F, que presenta las siguientes características:
| 9
kb de F con elementos necesarios para la replicación y la estabilidad
segregacional:
| ||||||||
| Gen bla para resistencia a ampicilina | ||||||||
| Módulo de clonación
para la expresión:
|
Este plásmido es estable en ausencia de presión selectiva, tiene una expresión génica bien controlada e impone una pequeña carga metabólica.
| Para la mayoría de aplicaciones, necesitamos promotores fuertes y regulables |
| El nivel de expresión debería variar directamente y a ser posible linermente con la cantidad de inductor |
| Debería de poder inducido uniformemente cuando se estimule |
Desgraciadamente, los promotores investigados, especialmente el de lac, muestran respuestas del tipo “todo o nada”, que se piensa se deben al acoplamiento de la expresión del gen que codifica el transportador para el inductor. Esto supone una mayor carga metabólica para las células que expresan los genes. La solución lógica es desacoplar el control del gen del transportador respecto del control del inductor, o eliminar el gen del transportador del inductor y usar análogos del inductor (como el IPTG) que difunden fácilmente a través de la membrana.
En otro lugar hemos hablado de los promotores más usados (lac, araBAD), a los que hay que sumar el Pm de la ruta meta de los y Pu de la ruta upper de los plásmidos TOL de Pseudomonas.
En última instancia, la ingeniería metabólica tendrá que intentar la expresión de diferentes genes a partir de diferentes promotores, y de hecho ya hay varios ejemplos de esta estrategia.
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