Inicio T. Alimentaria - T. General - T. Clínica - T. Ambiental - T. Industrial
   
 

Determinación colorimétrica de la actividad colinesterasa eritrocitaria


 Introducción


 Fundamento


 Metódica
 

    Reactivos y Material
 

    Procedimiento
 

    Video Completo


 Cuestiones y Cálculos
PROCEDIMIENTO:

A. Preparación del lisado de eritrocitos   VER SECUENCIA

Utilizar para el ensayo sangre venosa con Heparina

  1. Centrifugar a 3000 rpm/10 min.   VER FOTOS

  2. Señalar en el tubo el nivel original de líquido. Separar el plasma y la capa amarillenta con una pipeta pasteur de plástico.   VER FOTOS

  3. Agregar ClNa 9/1000 hasta la señal. Mezclar por inversión suave y centrifugar de nuevo a 3000 rpm/5 min. Retirar la capa superior con una pipeta pasteur de plástico y desecharla.   VER FOTOS

  4. Agregar de nuevo ClNa 9/1000 hasta la señal en el tubo y repetir el lavado como en el punto 3. Desechar la capa superior y diluir el sedimento de eritrocitos con solución salina hasta el volumen inicial (hasta la señal hecha en el tubo).
     VER FOTOS

  5. Mezclar perfectamente y medir el hematocrito de la suspensión. (Para hacer los cálculos se puede tomar como valor aproximado: 40%).

  6. Diluir la suspensión salina de eritrocitos con agua destilada en proporción 1:50 antes del ensayo.   VER FOTOS


B. Determinación de la actividad AchE

  1. Preparar 5 tubos de ensayo de plástico con los reactivos que se indican y mezclar agitando suavemente. Será el Medio de reacción.Rotular como tubo“A”, “B”, “C”, “D”, y “E”.   VER FOTOS -- VER SECUENCIA

        Medio de Ensayo:
             Tampón fosfato 100 mM pH 8,0 ............... 2,9 ml
             Solución de DTNB 10 mM.......................... 140 µl
             Solución de acetiltiocolina 15 mM............ 140 µl

  2. Colocar los tubos en un baño de agua termostatizado a 25 ºC e incubar 3 minutos.   VER FOTOS

  3. Agregar 140 µl del lisado de eritrocitos al tubo “A” (muestra Control).
    VER FOTOS -- VER SECUENCIA

  4. Agitar y con ayuda de un cronómetro medir la densidad óptica (D.O) a 410 nm a los 30 segundos de iniciada la reacción y luego cada 30 segundos durante un periodo de 3min.   VER FOTOS -- VER SECUENCIA

  5. Transferir 2 ml del lisado de eritrocitos 1/50 a los tubos de ensayo “PT” y “PX” que contienen paratión y paraoxón, respectivamente e introducirlos en el baño termostatizado a 25 ºC.   VER FOTOS -- VER SECUENCIA

  6. Tras 10 minutos, tomar 140 µl del tubo “PX” y añadirlos al tubo “B” . Tomar lecturas de la D.O a 410 nm cada 30 segundos durante 3 min. Anotar el momento exacto de la lectura si no se hace a los tiempos predeterminados.
    VER FOTOS -- VER SECUENCIA

  7. A los 15 minutos, tomar 140 µl del tubo “PT” y añadirlos al tubo “C”. Tomar lecturas de la D.O a 410 nm cada 30 segundos durante 3 min. Anotar el momento exacto de la lectura si no se hace a los tiempos predeterminados.
    VER FOTOS -- VER SECUENCIA

  8. A los 20 minutos y 30 minutos repetir la determinación de la actividad enzimática en el tubo “PX” agregando 140 µl de este tubo a los tubos de ensayo “D” y “E” respectivamente. Anotar el momento exacto de la lectura si no se hace a los tiempos predeterminados.   VER SECUENCIA
Diseño Web: AreaBinaria