METODOS

Tinciones

Tinción de Gram

1.1.  Fundamento y factores que afectan el resultado de la tinción.1.2.  Método.1.3.  preparación de la muestra .1.4.   Microorganismos, colorantes y reactivos .1.5.  Técnica de tinción.1.6.  Resultados.1.7.  Auto evaluación.

Encontrará información más completa sobre la pared de las células bacterianas en los apuntes on line del Profesor E. Iañez

Fundamento: mucopéptido, etanol y diferencias de color.

Las bacterias Gram negativas pierden un colorante (el cristal violeta) con mayor facilidad que las Gram positivas. La razón es la menor cantidad de mucopéptido de las paredes de las bacterias Gram negativas-esquema
Etanol La diferenciación se hace añadiendo pequeñas cantidades de etanol a las células teñidas con cristal violeta. El citoplasma de las células que han perdido el cristal violeta se tiñen con otro colorante (safranina). La diferencia de color se relaciona con el tipo de pared bacteriano: células de color violeta (bacterias de pared Gram positivas) y células de color rosa (bacterias de pared Gram negativa).
Diferencia de color

En realidad la diferencia de color no es específica de la pared bacteriana: todas las células sin pared (como las animales) pierden fácilmente el cristal violeta (se verán de color rosa). Todas las células con pared gruesa (como las de hongos) se verán de color violeta. La correlación entre el color y el tipo de pared solo tiene sentido con células bacterianas (salvo excepciones).
Cristal violeta El cristal violeta es básico (se une a componentes celulares de carga negativa). Atraviesa la envuelta celular y se acumula en el citoplasma. Para facilitar la diferenciación se mezcla lugol con cristal violeta: el complejo cristal-violeta-lugol precipita. Así el lugol dificulta la salida del cristal violeta de ambos tipos de células, pero es más fácil de extraerlo de las Gram negativas que de las Gram positivas
Decoloración y safranina Cuando se añade etanol a una mezcla de células Gram positivas y Gram negativas teñidas con cristal violeta, las células Gram positivas quedan teñidas de violeta :  no puede atravesar la gruesa capa de mureína (pueden hacerlo si se prolonga excesivamente el contacto con el alcohol). La pared de las bacterias Gram negativas debe su rigidez a una capa de mureína mas delgada, a través de la cual el alcohol extrae el cristal violeta  de estas células. Su citoplasma queda incoloro y puede teñirse de color rosa con el colorante de contraste: la safranina

Estructura de bacterias

 		 En el curso que se indica se resumen y esquematizan paredes bacterianas y la tinción de gram

Factores que afectan el resultado de la tinción

 		 La edad de las células, las condiciones de cultivo y la actividad de sus autolisinas pueden afectar el resultado de la tinción. Las células envejecidas, o crecidas en condiciones que impiden la síntesis de mucopéptido pueden verse de color rojo. La intensidad de la decoloración con alcohol suele ser el problema mas común
Material necesario

 Cultivos de  Staphylococcus aureus y de  Escherichia coli. Cristal violeta, lugol,  safranina, agua y etanol .
Método de la tinción de Gram: cristal violeta Coloración con cristal violeta durante dos minutos
Verter el exceso de cristal violeta
lugol Añadir lugol sobre la preparación con restos de cristal violeta .Teñir durante dos minutos
Etanol vídeo Decolorar con etanol  y eliminar el exceso de alcohol (La decoloración es el paso mas importante. El tiempo debe ser  suficiente para que deje de desprenderse cristal violeta de la preparación sin decolorarla completamente).
  Lavar con agua inmediatamente
Safranina Teñir con safranina durante dos minutos. Secar la preparación (vídeo) y observarla con objetivo de inmersión

Resultado

 E. coli (bacilos rosa) y S., aureus (cocos violeta)