Se acaba de graduar como licenciado en Biología por la Universidad de Granada
(Esta es la segunda parte de este artículo )
10. Aplicaciones de la terapia génica en humanos
10.2 Fibroblastos de la piel usados en terapia génica
10.3 Terapia génica aplicada a hepatocitos
10.4 Linfocitos modificados genéticamente
10.5 Utilización de células hematopoyéticas en la expresión de células en animales
10.6 Deficiencia de adenosín desaminasa en humanos
10.7 Transferencia de mioblastos usada para tratar la distrofia muscular de Duchenne
11. La terapia génica en el plano jurídico
12. Terapia génica: perspectivas futuras y consecuencias
14. La ética en la terapia génica
El tratamiento está basado en la obtención previa de células del paciente procedentes de un tejido u órgano de interés. A continuación se procede a la disgregación de las mismas y su mantenimiento en condiciones de cultivo de tejidos in vitro, en donde las células son posteriormente transfectadas por el " gen terapéutico" utilizando para ello un vector adecuado. Las células transfectadas son seleccionadas en función de su capacidad para expresar el gen exógeno de forma estable y persistente. Las células así seleccionadas son amplificadas y recolectadas con el fin de ser reimplantadas al paciente. También se puede utilizar líneas celulares alogénicas en aquellos casos en los que el órgano o tejido de interés no puede ser extraído con facilidad o que ofrece dificultada in vitro.
 | Químicos: Fosfato cálcico. |
| Físicos: Electroporación, Microinyección, Bombardeo de partículas |
| Fusión: Complejos ADN-liposomas |
| Endocitosis mediada por receptor: Complejos ADN-proteína, Complejos ADN-cápsida/ envoltura viral , Inmunoliposomas/liposomas destinados. |
| Adenovirus |
| Retrovirus |
| Virus Adeno-asociados |
| Herpesvirus. |
El tratamiento está basado en la administración sistemática de la construcción génica de interés. Aunque el ADN puede ser administrado de forma directa lo habitual es recurrir a la ayuda de algún vector que facilite el proceso de transferencia del gen y permita la entrada y localización intracelular del mismo, de tal forma que éste resulte en un gen funcionante. Así mismo, es importante recurrir a vectores con destinos específicos dentro del organismo lo cual permite la entrega celular selectiva del gen en un determinado órgano o tejido, sin requerir para ello procedimientos traumáticos o quirúrgicos.
| Inespecíficos
| ||||||
| Específicos
|
| Adenovirus |
| Retrovirus |
| Virus Adeno-asociados |
| Herpesvirus |
La decisión sobre si se debe llevar a cabo in vitro o in vivo la transferencia de genes depende de un gran número de factores, incluyendo los rasgos fisiológicos del tejido diana dañado, la naturaleza del tejido con respecto a los genes que deben ser transferidos, la facilidad para transferir los genes dentro de las células, la habilidad para llegar hasta ese tejido diana, su respuesta frente al método de transfección, etc. Así, el hecho de elegir un tipo de estrategia u otra es resultado de extensos y laboriosos estudios para cada tipo de trastorno.
De modo que no hay un patrón generalizado para cada enfermedad , y por tanto los investigadores se encuentran cada vez, con más obstáculos que resolver a la hora de llevar a cabo el ensayo. Por otra parte, algunos resultados, in vitro dan esperanzas sobre su aplicación in vivo, pero sin embargo los datos obtenidos de experiencias in vivo rozan en la mayoría de los casos el duro y desolador fracaso. Lo cual dificulta aún más si cabe las aplicaciones y desarrollo de técnicas en la terapia génica.
Como ya hemos visto la terapia génica supone la manipulación de las células utilizando procedimientos destinados tanto a reparar e incorporar nuevos genes en la célula como también a bloquear e inhibir la sobreexpresión de los mismos con fines terapéuticos.
Los oligonucleótidos son secuencias cortas de ácidos nucleicos diseñados para unirse a secuencias específicas de ADN (formación de ADN triplex) o ARN (formación de heteroduplex ARN-ADN). Los oligonucleótidos antisentido son complementarios de secuencias específicas de un determinado ARN mensajero (secuencia sentido) . La formación de un heteroduplex bicatenario sentido-antisentido bloquea la traducción del mensaje genético a proteína. Las estrategias antisentido tienen un gran potencial terapéutico para inhibir la expresión de genes en patologías tales como el cáncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas como el SIDA. Sin embargo, su utilización en clínica se ha visto limitada por su corta vida media en la circulación sistemática y su dificultad para acceder con actividad funcional al citoplasma y/o núcleo celular.
Más adelante en el apartado sobre aplicaciones sobre el cáncer se explicará este tipo de estrategia con mayor profundidad.
Es una estrategia destinada a reparar genes cuya alteración es originada por una mutación puntual conocida y el objetivo es activar selectivamente los mecanismos celulares de reparación del ADN, el el lugar de la mutación. Para ello se diseñan oligonucleótidos específicos para secuencias genómicas adyacentes al lugar de la mutación, en cuyo extremo el oligonucleótido lleva un agente capaz de lesionar el ADN , mediante la formación de un enlace covalente con el nucleótido responsable de la mutación . La lesión selectiva del nucleótido mutado, desencadena el proceso celular de reparación del ADN que conduce a una normalización estructural y funcional del gen.
El término ribozima ha sido introducido para describir moléculas de ARN con actividad enzimática. Se ha identificado una enorme variedad de motivos catalíticos de ribozimas, todos los cuales catalizan reacciones en sustratos de ARN.Estas reacciones llevan a cabo la rotura y ligación de las cadenas en sitiosespecíficos. Una característica común para todos los ribozimas es el requerimiento del ión de un metal con carga divalente, como el magnesio Mg+2 , que participa en la reacción química. Diferentes centros catalíticos de ribozima han sido incorporados en ARNs antisentido, de tal forma que le dan la capacidad de aparearse con un ARN diana que son sustratos para dichos centros cortándolos en sitios específicos. La actividad del centro catalítico de ribozima da el corte y destrucción del ARN diana. Aparejando el ribozima con el sustrato necesitaría poco tiempo para cortar el ADN diana, inactivándolo funcionalmente.
Una vez que la diana ha sido cortada, el ribozima puede disociarse de los productos cortados y repetir el ciclo de unión , rotura y disociación. La habilidad de los ribozimas para cortar dianas y después reciclarlas proporciona una ventaja sobre los ARN antisentido estandar; así actúa estequiométricamente, y no destruye la función del ARN diana.
Los ribozimas pueden ser producidos química, bioquímicao biológicamente, y algunas características de los oligodesoxinucleótidos antisentido tales como modificaciones químicas en la cadena o en las uniones entre nucleótidos, pueden ser incorporadas dentro de la molécula del ribozima sintético, así añade estabilidada la molécula.
La especificidad de apareamiento de bases, puede ser usada para dirigir los ribozimas a sus dianas, de ese modo se sugirió desde etapas muy tempranas en el conocimiento de los ribozimas que estas moléculas únicas podrían ser creadas por ingeniería para reconocero aparearse con bases del ARN diana de cualquier célula o virus.
Aunque se han hecho significativos progresos en la ingenieria de ribozimas, todavía hay un montón de cosas que deben ser aprendidas en orden para optimizar la función del complejo de los ribozimas en el comportamiento intracelular. Hasta estos días, la mayoría de experimentos intracelulares con ribozimas han sido llevados a cabo con los ribozimas denominados "cabeza-martillo" (hammerhead). De cualquier manera, otros motivos de ribozimas, tales como los llamados "horquilla" (hairpin), comparte mucho de los mismos requerimientos básicos para maximizar la eficacia intracelular. Así, la aplicación con éxito del ribozima "cabeza-martillo" debería proporcionar valiosas lecciones para aplicaciones de otros motivos de ribozimas.
La simplicidad del dominio catalítico de "cabeza-martillo" lo ha hecho popular en el diseño de ribozimas que actúan en trans. Los requerimientos en el sitio de corte son relativamente simples, y virtualmente cualquier UX (donde X es U, C o A) pueden ser dianas, aunque la eficiencia de la reacción de rotura varía entre diferentes combinaciones.
Por otro lado una versión de ingeniería del ribozima "horquilla", también llamado "grapa", ha sido capaz de cortar y reciclar múltiple variedad de dianas en trans. Aunque hay una serie de cambios en el sustrato para este tipo de ribozima. Entre éstos, incluye una G obligatoria junto al sitio de rotura en el 3'. Por otro lado, hay bastante flexibilidad en las combinacionesde secuencia guía-sustrato, lo que hace que tenga un potencial éxito contra una amplia variedad de ARN diana. Estos ARNs catalíticos son relativamente simples y pueden ser construidos para esconder secuencias que faciliten el apareamiento de bases frente a un ARN deseado.
Hay cinco áreas de investigación que podrían llevar a un aumento en la eficacia intracelular de los ribozimas. Estos son:
| El reparto de ribozimas a células apropiadas. |
| La eficiente expresión de los ribozimas en estas células. |
| La co-localización de los ribozimas y el sustrato de ARN diana en el mismo compartimento. |
| La especificidad de los ribozimas para reconocer y cortar sólo la diana del sustrato de ARN. |
| El aumento del reciclaje del sustrato mediado por los ribozimas. |
El efectivo uso de ribozimas como agentes terapéuticos depende de los métodos ideados en el reparto de construcciones de genes de ribozimas para que de la expresión de los ribozimas en las células dianas apropiadas.
El reparto se puede llevar a cabo por los diferentes métodos que hemos visto. Hasta el día de hoy, el sistema más explotado se hace usando vectores de retrovirus. Estos vectores pueden ser construidos para esconder entre la ARN polimerasa II y III unidades de transcripción para la expresión de ribozimas . De cualquier manera, la utilidad general de los vectores retrovíricos en la terapia génica basada en los ribozimas puede ser limitada por la baja eficiencia de transducción en células primarias, debido a la integración al azar del ADN viral y la frecuente silenciación transcripcional de los genes codificados.
Otro vector desarrollado para este reparto son los virus adenoasociados (AAV) los cuales tienen una elevada eficiencia de transducción y la potencial integración en una localización única en un cromosoma. Los adenovirus por su parte no garantizan la integración del vector viral. En métodos virales sin embargo no dan el reparto de los genes de ribozimas ex vivo, lo cual dificulta un poco la manipulación y el éxito del sistema.
La elección del contexto de la secuencia del promotor para la expresión intracelular de los transcritos de ribozimas, es uno de las decisiones más importantes que necesitan ser hechas para una aplicación intracelular con éxito de ribozimas. Las mayores consideraciones son la elección de un sistema de expresión ( ejemplo, inducible, específico del tejido o promotores constitutivos) , y los posibles efectos adversos o útiles de secuencias en cis- que se requieren para dar el "cap" en el ARN, la terminación del transcrito y la exportación desde el núcleo al citoplasma.
De modo esquemático presentaremos algunas de las últimas innovaciones en este campo.
a) Representa fusiones del represor (R) de la tetraciclina (TET) con el virus del herpes simple (HSV) y su transactivador VP16; las fusiones están unidas a el operador de TET que está posicionado aguas arriba de un promotor basal. En ausencia de tetraciclina, el complejo se une a la región operadora, activando la transcripción. En presencia de tetraciclina, la transcripción es "apagada" porque el represor interactúa con el antibiótico y no puede alargarse la unión a los operadores. UTR son regiones no trasladables.
b) y c) representan promotores en cassette de la polimerasa III derivados de un ARNt. La ribozima reemplaza o parte del lazo del pseudouracilo por un aceptoraminoacílico (en b), ó está insertado dentro del anticodón del lazo (en c).
En ambos casos, las cajas A yB están insertadas intactas y son requeridas para la expresión; una hilera de 5 timinas (uracilos en ARN) terminan la transcripción.
d) muestra una representación de un promotor para un ARN nuclear pequeño (ARNns) U6. Este es un promotor de polimerasa III similar a el del ARNt; de cualquier manera, los elementos de regulación del promotor están aguas arriba de la región que codifica el "maduro" . La construcción de ribozima está posicionada inmediatamente después de la señal para dar el "cap" (una pequeña estructura en lazoy un corto tramo de nucleótidos unidos o adyacentes) así una apropiada unión del cap al transcrito puede tener lugar. La terminación de la transcripción está señalizada por una región de 5 timinas (uracilos en ARN). DSE representa potenciadores a larga distancia, y PSE es un elemento de secuencia próxima. El transcrito de la polimerasa II y del promotor U6 se les unen la caperuza, mientras que los ARNt transcrito no tienen.
Las estrategias para potenciar la accesibilidad del ARN diana juntamente con la ribozima en un complejo compartimento intracelular es un aspecto intensamente estudiado por ser de interés en la optimización de la función intracelular de la ribozima.
Las primeras investigaciones fueron llevadas a cabo por Sullenger y Cech , que demostraron que la co-localización de un ribozima con el ARN diana daba una mejora importante en la eficiencia de un ribozima "cabeza-martillo". En este experimento el ribozima y la diana están co-localizados vía vector retroviral. Así el ribozima era sólo efectivo cuando los ARNs eran co-empaquetados.
Todavía se conoce poco sobre los mecanismos que regulan las vías de movimiento de transcripción a translación para la mayoría de los ARNs.
Los transcritos nucleares están procesados y migran a través de vías específicas. No se puede pronosticar por tanto la ruta y la distribución de los transcritos nucleares. Así, hay numerosos ejemplos de ARNs que se localizan en regiones específicas del citoplasma. La estrategia de co-localización puede cojer la ventaja de varios eventos de procesamiento post-transcripcional que tienen lugar en el núcleo de la célula.
La inserción de ribozimas que actúan en trans- en ARNs que son dirigidos dentro del núcleo, pueden ser usados para concentrar ribozimas dentro del núcleo.
La co-localización de ribozimas con ARNm en el núcleo puede ayudar a aumentar la posibilidad de la interacción ribozima-diana antes de que la translación ocurra en el citoplasma.
Para muchas dianas, el mejor compartimento para la interacción con un ribozima puede determinarse sólo empíricamente. Por lo tanto, es importante que diferentes estrategias se intenten en orden para determinar cual es la más eficaz para un ribozima dado y combinación de diana.
El apareamiento específico de bases determina la selleción de un ribozima para una diana. Como todas las secuencias de ribozimas tienen diferente potencial en las interacciones de apareamiento de bases, una acumulación de datos de diferentes experimentos de ribozimas requeridos para una rigurosa valoración de combinaciones óptimas en la composición y longitud de las secuencias que aparean. A su vez, mutaciones en el sitio de rotura pueden afectar a la eficiencia del ribozima.
Como conclusión, podemos decir que los ribozimas son ARNs catalíticos que pueden actuar como una endoribonuclesa de secuencia específica, para lo cual utilizan unas Secuencias Guía Internas (IGS) que le permiten unirse a secuencias complementarias (antisentido) de un determinado ARN. Mediante mutaciones del elemento IGS es posible cambiar la especificidad del ribozima hacia un ARN específico conteniendo las secuencias complementarias a la nueva secuencia de la región IGS. Se han aprobado ensayos clínicos utilizando ribozimas en pacientes con SIDA, con el fin de intentar degradar moléculas específicas de ARN en las células infectadas con el VIH.
Existe una gran esperanza para pacientes afectados que puedan ser tratados por terapia génica, por la cual, se le sustituye un gen defectivo por un gen normal. Aún así, los obstáculos que supone la terapia génica son muy importantes. Se necesita mucha información sobre la patología molecular de un desorden genético, antes de que los investigadores puedan decidir si este desorden es factible a la terapia génica, y si es así, también habría que tener en cuenta diferentes asusntos sociales y éicos. El gen en cuestión debe ser clonado y además debe existir una manera segura de introducir el gen en las células. Los primeros experimentos en los que células tratadas genéticamente o manipuladas, y fueron introducidas en pacientes humanos comenzaron en 1.989, y las primeras pruebas clínicas sobre terapia génica, para las eficiencia de adenosin desaminasa, comenzaron el Septiembre de 1.990.
A continuación discuteremos las técnicas de terapia génica empleadas en las diferentes enfermedades humanas así como sus problemas y resultados.
Se han utilizado muchos experimentos en los que se usaron cultivos celulares para encontrar un camino eficiente para introducir genes humanos en células sin que sufran reordenamientos u otras alteraciones que puedan afectar a la expresión génica, es decir, que el gen introducido sea estable.
El gen para la fibrosis quística (CF) era un objetivo importante para la terapia génica. In vivo se habían descrito anormalidades en la conductancia en los canales de cloro, y una línea celular CF- expresaba el mismo defecto. Esta línea celular se utilizó en ensayos que intentaban estudiar la actividad del gen CF introducido en la célula. Uno de los vectores que más se han utilizado en la lucha contra la fibrosis quística ha sido el vector retroviral. Un ADNc para el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) era construido por el solapamiento de tres clones ADNc, y un ADNc completo era clonado en un vector retroviral. Las células CF- eran infectadas por un vector retroviral que llevaba un gen CFTR, y la célula con el provirus integrado eran seleccionadas por su resistencia al G418. Las células expresaban el gen CFTR. Los datos más interesantes procedían de las medidas del grado de funcionamiento de los canales para el cloro. El flujo aniónico de las células en respuesta a una estimulación por la adenilato ciclasa proporciona una conductancia para el cloro semejante. En ausencia de un determinado estimulador de la adenilato ciclasa, el flujo aniónico de las células CF- y de las células CF- que contienen el gen CFTR introducido se pierde. Si se le adiciona este determinado activador de la adenilato ciclasa, el flujo aumenta rápidamente en células CF- con CFTR , pero en las células CF- el flujo permanecía bajo. Se utilizaron técnicas electrofisiológicas para determinar si la conductancia para el cloro influía en ese flujo aniónico. Estos experimentos mostraron que las corrientes de cloro se detectaban únicamente en las células CF- con CFTR. Significativamente, la respuesta de las células CF- con CFTR es comparable con las respuestas traqueales humanas normales y alienta la esperanzas de que la terapia génica para la fibrosis quística , usando vectores retrovirales directamente sobre el epitelio pulmonar por medio de aerosoles, sea posible.
Un tipo de células que sirve como vehículo para transferir genes son los fibroblastos de la piel. Estas células han sido usadas en pacientes afectados de mucopolisacaridosis, que es una enfermedad hereditaria que se caracteriza por la deficiencia de enzimas lisosomiales. Los fibroblastos se obtienen fácilmente crecen bien en cultivo, y pueden ser infectadas eficientemente con vectores retrovirales. Por ejemplo, las células de un paciente afectado por la enfermedad de Gaucher (deficiencia de glucocerebrosidasa) eran infectadas con un vector retroviral que contenía un ADNc de la glucocerebrosidasa. Los niveles de enzima en las células infectadas alcanzó el nivel de las células normales.
En el caso de la deficiencia de adenosín desaminasa, los fibroblastos de la piel infectados con un retrovirus que llevaba un ADNc de ADA producía más ADA que las células normales. Los investigadores calculan que se necesitan más de 4x10e8 fibroblastos tratados genéticamente para producir efecto terapéutico en pacientes.
Una cuestión importante sería conocer si los fibroblastos de la piel podrían sintetizar y secretar gran cantidad de una proteína que no es un producto normal de esa célula. Por ejemplo, ¿podría un fibroblasto de la piel tratado genéticamente ser usado para producir el factor IX en pacientes con hemofilia B? Los fibroblastos humanos son infectados in vitro por un vector retroviral basado en un MoMLV, que contiene un ADNc del factor IX dirigida por un promotor intensificador de un citomegalovirus. Por radioinmunoensayo sedeterminó que estas células infectadas producían gran cantidad de factor IX. Este factor IX es completamente funcional e indistinguible del factor IX original del plasma.
Como conclusión, los últimos avances a la hora de perfeccionar las técnicas tanto en el cultivo de células de la piel como de producir vectores estables y fiables para expresar e introducir información genética en estas células, unidos a la relativa facilidad con que estos cultivos son transplantados , hacen suponer que,en años venideros, la piel será uno de los primeros y más atractivos sistemas para corregir enfermedades mediante terapia génica, contribuyendo así a la revolución de los métodos terapéuticos que esta nueva disciplina, sin duda, introducirá en la Medicina.
Otro tejido diana para la terapia génica es el hígado . Un gran número de enfermedades metabólicas hereditarias afectan al hígado, y el transplante de hígado ha sido utilizado para tratar estas enfermedades y otras como son la hipercolesterolemia y hemofilia. Estas técnicas se han desarrollado a partir de aislamiento y cultivo de hepatocitos. Ejemplos de la utilización de estos hepatocitos es el estudio y tratamiento por terapia génica de la hipercolesterolemia en humanos. Esta es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR), y aquellos pacientes que son homozigóticos para la mutación del gen de LDLR generalmente mueren por un ataque al corazón antes de los 20 años. En este experimento los vectores retrovirales que llevan el gen para el LDLR humano se usan para infectar cultivos de hepatocitos. Se obtenían líneas celulares que eran capaces de degradar las lipoproteínas de baja densidad a un nivel más o menos normal. Hasta ahora este experimento sólo se ha utilizado en cultivos celulares ¡, aunque es uno de los más seguros a probar en individuos.
Un experimento que se quiere hacer en humanos y que ahora sólo se hace en ratones es transferir los genes alfa-1 antitripsina humanos (hAAT) y el gen beta-galactosidasa de E. coli a hepatocitos.
Un sistema de entrega a células de melanomas malignos está siendo utilizada en experimentos clínicos. Los linfocitos infiltrantes en tejidos (TILs) son linfocitos que se infiltran el tumores sólidos y que pueden matar células tumorales si se administran junto a la interleuquina 2 (IL-2),que es un factor decrecimiento de linfocitos. Cuando los TILs eran aislados de melanomas malignos, estimulados en su crecimiento en un cultivo tisular con IL-2, y se inyectaban de nuevo al paciente, en ocasiones producían la regresión del melanoma. Para intentar conocer como los TILs trabajan in vivo, es importante conocer cuantos de los TILs transplantados sobreviven y si alcanzan los tumores. Una estrategia que se ha desarrollado para seguir los TILs inyectados al paciente es marcarlos con retrovirus. La primera vez que se hizo este experimento en células humanas genéticamente modificadas se utilizó un vector retroviral que llevaba el gen de resistencia a la neomicina. Antes de que los experimentos clínicos comenzaran, se ha visto que los TILs eran eficientes y establemente infectadas con un vector, que eran muy resistentes al G418 y de que la integración retroviral no alteraba la característica de crecimiento de las células. Cinco pacientes fueron tratados con estos TILs. Se le retiró al tumor a cada paciente y los TILs se hicieron crecer en un cultivo con interleuquina-2 . Las células infectadas con un vector retroviral en los que los genes gag, pol y env fueron sustituidos por el gen para la resistencia a la neomicina. El porcentaje de las células en las que el neogén se había integrado establemente era del 1-11%. Los pacientes recibieron al menos 10e11 TILs que procedían de sus propios tumores. Muestras de sangre tomadas en días siguientes fueron sometidas a la PCR, y se vio que los TILs modificados genéticamente que contenían el neogén estaban presentes en tres pacientes. Sesenta días después sólo se detectaba en dos pacientes. Aún así, se encontraron células que contenían el neogén en muestras de tejido tumoral, pero no está claro si estas células tomaron este neogén por suerte o por transferencia de un vector. La conclusión que se sacó, es que los TILs son útiles para tratar células tumorales, pero todavía no se ha comprobado el rendimiento que puede sacarse de esta facultad ya que los resusltados son contradictorios según diferentes pruebas.
De la misma manera que el retrovirus actúa como un vector para transportar un gen a una célula, la célula puede ser considerada como un vector en el siguiente paso del proceso, que es transportar el gen al cuerpo del paciente. ¿Qué requisitos deben cumplir estas células? Deben ser fáciles de obtener, crecer bien en cultivo y de soportar la infección retroviral. Después de la infección, la célula vector debería ser fácil de devolver al paciente y debería continuar viva por varios meses, preferentemente por el bien del paciente.Las células de la médula poseen algunas de estas características. La médula contiene células stem que pueden dar lugar a todas las células de la serie hematopoyética. La infección de estas células stem hace que aparezcan diversas que contengan el gen terapéutico. También se han utilizado las células de la médula para tratar enfermedades hematopoyéticas, en otras palabras, las técnicas para reconstruir la médula de los pacientes se está trabajando intensamente. Uno de los mayores inconvenientes de usar células de la médula como vectores celulares, es que tienen dificultad de producir altos niveles de expresión del gen introducido. En uno de los experimentos, el gen intacto de la beta-globina humana con secuencias adyacentes en 3' y 5' son usadas en la cosntrucción de retrovirus. El retrovirus que lleva el gen de la beta-globina se inyectaba en las células de la médula y posteriormente se vio que eritrocitos que procedían de estas células medulares llevaban beta-globina funcional.
Se debe a un trastorno autosómico recesivo. Su deficiencia origina una disfunción intensa en las células T y B , que provoca la muerte de los pacientes antes de los dos años de edad por infección masiva. Se comenzó a estudiar su tratamiento por terapia génica en 1.990 para una mutación en el gen adenosín desaminasa. Los niños aquejados de este mal eran incapaces de iniciar una respuesta inmunitaria ante las infecciones y estaban abocados a una vida muy limitada, ( "niños burbuja"). Sin una especial atención morían irremediablemente.
Dos niños de cuatro y nueve años con deficiencia de ADA están recibiendo terapia génica. De los niños se aislan linfocitos T, a los que se les introduce un gen ADA normal usando un vector retroviral, y son devueltos a los pacientes. Los niños han estado recibiendo células con genes corregidos cada uno o dos meses durante un año y estos niños mostraron mejoras clínicas significativas. Ahora son capaces de iniciar una respuesta inmunitaria y se ha producido una importante decreción del número de infecciones. El niño de menor edad, que ha sido tratado por más tiempo, puede llevar una vida completamente normal. Estos resultados son muy esperanzadores, y si la terapia génica en células stem de la médula avanza, no será necesario un injerto continuo de cálulas modificadas.
Actualmente, el tratamiento preferido esel transplante de médula ósea de un donante HLA idéntico, que puede producir una curación completa aunque conlleva una alta morbilidad . Pero menos de un 30% de los pacientes tienen un hermano HLA idéntico. La sustitución enzimática no consigue una restitución completa y produce otros efectos tóxicos. Un tratamiento sustitutorio consiste en inyectar el enzima ADA combinada con polietilenglicol (PEG) permite en ciertos casos frenar los efectos de la enfermedad.Pero es un tratamiento muy caro, ininterrumpido y de eficacia inconstante.
Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se iniciaron hace ya más de cuatro años ensayos clínicos de transferencia génica de ADA hacia los linfocitos T periféricos, previamente tratados in vitro. Aunque algunos pacientes experimentaron una notable mejoría clínica e inmunitaria, los resultados difieren considerablemente de unos a otros y no llegan a normalizarse todos los índices de la función inmunitaria. En opinión de algunos, ni en este pionero ensayo ni en otros existen evidencias inequívocas de que el tratamiento genético ha producido beneficios terapéuticos . Los riesgos de posible mutagénesis insertiva de genes relacionados con el cáncer, después de repetidas transferencias retorvirales, no se han visto confirmadas hasta el momento . Pero los modestos resultados han estimulado otras propuestas de ensayos clínicos en Italia y Países Bajos. Según sus autores, en uno de estos últimos ensayos la transferencia genética había funcionado y se había conseguido la reconstitución inmunitaria. En todo caso, es preciso tener en cuenta que los pacientes estuvieron recibiendo también inyecciones rutinarias de ADA sintética, y estos tratamientos convencionales podrían ser responsables en buena parte de su buena salud.
Los mioblastos son las células stem del músculo esquelético. Durante el desarrollo, los mioblastos se fusionan para formar fibras musculares multinucleadas. Un pequeño número de mioblastos no se fusionan y forman células individuales, llamadas células satélite, que se situan entre las membranas de las fibras musculares y de la matriz extracelular que cubre las fibras musculares. Las células satélite poseen la habilidad de fusionarse con otras células satélite y fibras musculares para tomar parte en la regeneración muscular. Los mioblastos se convierten así en las células vector ideal para transportar genes a las fibras musculares.
Un obstáculo en la terapia génica de la DMD es que el gen y su ADNc son muy grandes. Esto se ha conseguido superar por la construcción con un ADNc completo para la distrofina, que se puede expresar en células. Dos ADNc biblióteca ( A y B ) fueron construidos en los cuales la reversotranscriptasa fue directamente a comenzar la síntesis de las primeras cadenas de ADN en dos puntos del ARN mensajero de la distrofina. Estos puntos se especificaron por suplantar dos primers que hibridaban por la mitad (biblioteca A) o con el extremo 3' (biblioteca B) del ARN mensajero. Estos clones contenían 78Kb. del extremo 5' del gen y 8 Kb. fueron aisladas del extremo 3' de la biblioteca A y B respectivamente. Estos clones fueron solapados en 18 Kb. y se ligaron a una porción de un sitio de restricción para dar un ADNc completo. Esto se clonó en un vector SV40 y se transfectó por electroporación en células COS. Usando anticuerpos para la distrofina demostraron que se producía una molécula correcta de distrofina en las células COS, y estudios inmunofluorescentes demostraron que se localizaba en la membrana celular. Aunque estos experimentos demuestran que genes grandes como el de la distrofina pueden ser manipulados in vitro, pero puede pasar mucho tiempo hasta que esta terapia pueda tener aplicaciones clínicas.
El diagnóstico del cáncer a nivel molecular permitirá un pronóstico más preciso; pero aún podemos llegar más lejos utilizando una terapia génica que tiene como finalidad la destrucción selectiva de la célula tumoral. La pérdida del oncosupresor p53 puede ser corregida introduciendo una copia sana en la célula neoplásica; la sobreexpresión del oncogen k-ras también puede suprimirse introduciendo el gen k-ras antisentido que inactive su expresión o bloquee sus ARNs. Los retrovirus permiten introducir genes, potencialmente suicidas, en el seno de un tumor ya que infectarán e insertarán su ADNc en células en división; los adenovirus, aunque no integren en el huesped pueden permanecer activos el tiempo suficiente para destruir el tumor. También es posible introducir en el tumor o en el organismo genes inmunoestimulantes, como la interleuquina (IL2) , que potencialmente protege de distintos tipos de cáncer y de sus recidivas. Las inmunotoxinas son el resultado de acoplamiento de toxinas muy letales (como la diftérica o la ricina) a anticuerpos monoclonales específicos de carcinomas, constituyendo las denominadas bombas biológicas, puesto que son como proyectiles letales dirigidos contra células tumorales. Por último , la terapia génica permite elaborar vacunas a partir de las propias células tumorales de un paciente por manipulación ex vivo y reinserción en el organismo de partida.
Dentro del campo de las aplicaciones de la terapia génica en el hombre, se puede considerar el cáncer como el área más importante y de más rápida expansión.
Las propiedades neoplásicas de numerosos cultivos celulares pueden revertirse con frecuencia, al insertar una copia normal de un oncosupresor como pueden ser rb, dcc o p53. Es muy posible que la introducción de p53 en un tumor que carezca de la función de este gen, pueda restaurar la normalidad tisular. Se están realizando ensayos clínicos en los que se depositan broncoscópicamente en las inmediaciones de un tumor de pulmón , retrovirus que llevan una copia intacta de p53. La eficacia de esta terapia se verá incrementada si en vez de hacer llegar al tumor un único oncosupresor, se elaboraran "lotes génicos" de varios oncogenes y oncosupresoresque simultáneamente corrijan las alteraciones acumuladas en las células del tumor. Un único vector que porte varios oncogenes/oncosupresores o una mezcla de vectores que contenga cada uno un tipo de oncogenes/oncosupresores son las dos modalidades con las que se especula en la actualidad.
Tanto los tumores sólidos como las leucemias y linfomas exhiben activación mutacional o sobreexpresión de oncogenes u oncosupresores mutados ; la malignidad de las células podría desaparecer impidiendo la expresión de los oncogenes y oncosupresores por administración de pequeños oligodesoxinucleótidos complementarios a los ARNs mensajeros y ADNs correspondientes.
Debemos aclarar, sin embargo, que este tipo de tratamiento difiere sustancialmente de las terapias genéticas tradicionales. En la mayoría de los tratamientos genéticos, se suministran genes enteros y sanso para sustituir las verisones que faltan o que son defectuosas e incapaces de dirigir la síntesis de una proteína necesaria. Los oligonucleótidos no pueden producir proteínas. Su virtud radica en la capacidad para bloquear la expresión de genes existentes.
Los oligonucleótidos antisentido son la primera de las nuevas medicinas genéticas que han llegado a la etapa de ensayo clínico. De su potencialidad terapéutica se sospechó ya a principios de los 80, cuando se descubrió que ciertos microbios, además de fabricar ARNs mensajeros, también producían de forma natural ARN antisentido. La explicación más lógica para este comportamiento parecía ser que el organismo utilizaba las moléculas antisentido como forma de regular la expresión génica. Si el ARN antisentido se empareja con su molécula complementaria de ARN mensajero, cabe pensar que bloqueará la maquinaria celular encargada de traducir en proteínas la cadena con sentido.
Las células vegetales y animales emplean a veces la estrategia antisentido para controlar la expresión génica. Con la ayuda de las técnicas del ADN recombinante crearon genes que producían versiones antisentido de ciertos ARN mensajeros seleccionados. Cuando se introducían esos genes en la células se comprobaba que, en efecto, ocasionalmente se conseguía disminuir la producción de la proteína cifrada por la cadena de ARN que era blanco del antisentido.
Los resultados sugerían la posibilidad de diseñar moléculas antisentido que funcionasen a la manera de drogas e impidiesen selectivamente la traducción. Sin embargo, para utilizarlas como tales drogas, había que enviarlas al interior de las células del cuerpo, y hacerlo de una forma fácil y eficaz. En la mayoría de los casos, lo mejor sería administrar pequeños fragmentos de antisentido sintéticos, en vez de genes enteros.
La construcción del primer oligómero surgió en 1.978, reconocía el ARN mensajero del virus del sarcoma de Rous y disminuía su replicación en la célula lo que indicaba que había bloqueado la producción de proteínas víricas.
Dos consideraciones a la hora de fabricar un oligonucleótido son: primero, los oligonucleótidos sin modificar portan una carga negativa en la cadena del grupo fostato. Las moléculas dotadas de carga suelen tener dificultades para atravesar las membranas celulares, que no están cargadas. La mayoría de los investigadores daban por supuesto que los oligómeros con muchas cargas serían incapaces de entrar eficazmente en las células. En segundo lugar, las células poseen numerosas enzimas que degradan el ADN foráneo. Cabía pensar entonces en una pronta degradación de los oligómeros que consiguiesen entrar en las células.
Para ello reemplazaron un átomo de oxígeno de cada grupo fosfato por un grupo metilo (-CH3 ). Convertían así los fosfatos cargados negativamente en unidades sin carga: los metilfosfonatos. De esa menera los oligonucleótidos entraban mejor en las células y resistían el ataque enzimático. Pero al eliminar las cargas, los oligómeros se volvían hidrofóbicos y se hacían insolubles en soluciones acuosas, esta falta de solubilidad puede dificultar la producción en masa.
Otra alternativa a los metilfofonatos era intercambiar un átomo de oxígeno de los grupos fosfato por un átomo de azufre cargado negativamente. Estos oligómeros fosfotiolados son conocidos como oligos S, que son solubles en agua, fáciles de producir y reistentes a la degradación enzimática.
Los oligonucleótidos antisentido pueden bloquear la traducción al menos de dos maneras. Obstaculizan la "lectura" normal del ARN con sentido. y, además, al unirse al ARN mensajero estimulan a una enzima (ribonucleasa H) que corta, y por tanto destruye, al ARN mensajero que participa en la unión.
Los oligonucleótidos son muy caros y la estabilidad de los compuestos debe mejorarse. Habrá que elaborar métodos más idóneos para introducirlos en las células en las cantidades adecuadas.
Una nueva estrategia genética está basada en los llamados tríplices, que son oligonucleótidos sintéticos que actúan igualmente pero a nivel del ADN, en este caso una tercera banda se acomoda entre las dos existentes en el surco mayor de la forma B del ADN. Hoy sabemos que los oligonucleótidos suelen unirse a una de las cadenas de la doble hélice, y sólo a las bases púricas de esa cadena mediante uniones de tipo Hoogsteen. Así, los oligonucleótidos son capaces de unirse a la región de control del gen diana, para impedir que los factores de transcripción iniciasen dicho proceso.
Hasta el momento in vitro, han tenido éxito oligonucleótidos contra ras, p53, myc, myb, bcr-abl, bcl-2 y contra el factor de crecimiento semejante a la insulina.
Se encuentran el fase clínica la utilización de oligonucleótidos contra el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) que va asociado al desarrollo de tumores cerebrales malignos (glioblastomas). En la fase preclínica, se introdujeron in vitro moléculas de ARN antisentido en células tumorales procedentes de un glioblastoma de rata, estas células se inyectaron en ratas genéticamente idénticas con tumores cerebrales. Los tumores desaparecieron incluso en ratas con tumores extendidos a otras partesdel cuerpo. Las células introducidas desencadenaron una respuesta inmunológica estimulando células T citotóxicas que erradicaron el tumor o los tumores a la vez que protegieron al organismo de la aparición de nuevos microtumortes. En las pruebas clínicas, son células del propio paciente las que se modifican ex vivo con la introducción del ARN antisentido. Se ha elegido ARN en vez de ADN para el bloqueo del ARN mensajero de IGF-1 porque los híbridos ARN-ARN son más estables que los ADN-ARN.
La inhibición de la expresión del oncogen ras se puede conseguir in vitro con la inserción en la células tumorales de genes que transcriban un ARN mensajero antisentido, complementario al ARN mensajero normal del oncogen ras. Estos antigenes eliminan específicamente la producción del producto ras anormal a nivel de ARN mensajero por hibridar con él , impidiendo así que sean sustrato de traducción por los ribosomas celulares. El mayor problema de esta terapia génica es asegurarse de que todas las células tumorales reciben el oligonucleótido antisentido, ya que cualquiera que escape tendrá una ventaja proliferativa sobre las otras y prevalecerá induciendo de nuevo el tumor.
El segundo método de bloqueo del oncogén ras actúa a nivel de proteína. La proteína Ras ocupa una posición importantísima en la transmisión deseñales para que la célula responda a los factores de crecimiento. Las mutaciones Ras producen una transmisión continua de señales de proliferación independientemente de la presencia de los factores estimulantes. Tanto la proteína Ras normal como la mutada precisan de una transformación o maduración que las convierta en proteínas biológicamente activas y esta modificación consiste en una farnesilación, es decir, la adquisición de un grupo farnesil que permitirá a la proteína anclarse en su lugar habitual de la membrana celular, desde donde transmite la señal de proliferación. La farnesil transferasa es la enzima que normalmente facilita el grupo farnesil; así, inhibidores de la enzima impedirán que Ras adquiera su forma biológicamente activa. El compuesto CBBX ( cisteína, 2 Benzodiacepinas y un aminoácido variable) es muy buen inhibidor de la farnesil transferasa y parece inócuo para las células. Células transformadas en cancerosas por haberles introducido un gen ras mutado, se incuvaron en presencia del compuesto CBBX, impidiéndose de modo muy eficiente la farnesilación y observándose un crecimiento típico de células normales no cancerosas. La inhibición no ha de ser total puesto que las células necesitan una cierta cantidad de Ras para funcionar correctamente; además hay otras proteínass que han de farnesilarse para adquirir su capacidad funcional. Es necesario controlar muy bien las dosis para que se inhiba la enzima lo suficiente para impedir un crecimiento incontrolado, pero permitiendo el resto de las funciones de la célula.
La inhibición de oncogenes en células tumorales in vitro es un requisito imprescindible para su utilización in vivo. En animales de experimentación (ratas) estas técnicas han logrado la desaparición de tumores experimentales sin aparición de recidivas o secuelas de otro tipo.
Los vectores suicidas que se emplean para erradicar tumores son preferentemente retrovirus defectivos en los que los genes propios del virus ( gag, pol y env) han sido sustituidos por un gen de selección (neo) y por otro gen capaz de inducir su propia muerte. Un ejemplo de gen suicida es el gen de la timidina quinasa (tk) del Herpes simplex (HS), que al expresarse en la célula tumoral confiere sensibilidad al antibiótico antiherpético ganciclovir. La quinasa del Herpes no es tan estricta como su homóloga celular y fosforila análogos de la guanina (ganciclovir o aciclovir), que pueden así ser insertados e incorporados en la molécula del ADN paralizando la replicación y provocando la muerte celular.
Solamente aquellas células que hayan adquirido la quinasa del Herpes incorporarán células en división, característica diferencial de las céluas tumorales que se desarrollan en tejidos especializados, las cuales normalmente ya no se dividen. El cerebro adulto es uno de los órganos en los que no hay divisiones celulares en condiciones normales. El sistema se ha puesto a punto en la rata, donde pueden ser inducidos tumores cerebrales malignos por inyección directa de células neoplásicas.
Los retrovirus portadores del gen tk del HS se introdujeron en las células murinas empaquetadoras que poseen en su genoma un retrovirus defectivo. Este retrovirus defectivo es poseedor de los genes que se eliminaron del retrovirus para convertirlo en vector ( gag, pol y env ), pero carece de una región imprescindible para el empaquetamiento de la partícula; estas célula murinas se convierten entonces en fábricas de retrovirus terapéuticos y se denominan células productoras. La introducción en el seno de un tumor cerebral de células productoras origina un gran número de retrovirus que infectarán lógicamente las células próximas del tumor. Al cabo de unos días, en los que cada vez más células tumorales adquieren el retrovirus terapéutico, se inicia el tratamiento de la rata con el ganciclovir, que , efectivamente es capaz de provocar el suicidio de todas las células tumorales .
En humanos, el mismo tratamiento de tumores cerebrales malignos por terapia génica con retrovirus portadores del gen tk del Herpes, se encuentra en la actualidad en fase de ensayos clínicos; el tratamiento del enfermo con ganciclovir produce en algunos casos la disminución del tumor tratado. Tratamientos similares se están aplicando también a otros tipos de tumores, como melanomas cutáneos o cánceres de ovario.
Una variante más versatil y selectiva se podría conseguir añadiendo al gen suicida un promotor de células tumorales. Se conocen algunos genes que se expresan preferentemente en determinados tumores, en muchos de estos casos se han aislados los promotores y se han acoplado enzimas que confieren un efecto suicida.
Un promotor específico de un tipo de tumores impediría que la enzima suicida se expresara en cualquier otra célula distinta a la neoplásica, aunque pudiera ser infectada por el retrovirus terapéutico por encontrarse en fase proliferativa. Se prevee su suso clínico en un futuro próximo para hepatomas, melanomas, cánceres de mama y cánceres de páncreas.
Con el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales surgió la idea de elaborar inmunotoxinas para el tratamiento del cáncer acoplando anticuerpos tumorales específicos a toxinas mortales. Estas inmunotoxinas se unirían y matarían células neoplásicas. Se les denominó bombas biológicas o balas mágicas, ya que funcionan como proyectiles dirigidos para hacer blanco en células cancerosas. Problemas de toxicidad en las aplicaciones terapéuticas pusieron de relieve que simplemente pegando un anticuerpo a una toxina no se curaría el cáncer. Aunque no se han resuelto todos los problemas originales,se puede decir que las inmunotoxinas actuales están muy mejoradas y ya se están realizando ensayos clínicos que permitirían muy pronto evaluar el alcance de esta tecnología en la cura del cáncer. Para eliminar un cáncer humano todas las células neoplásicas deben quedar expuestas a suficiente cantidad de inmunotoxina como para provocar su destrucción sin causar daños adicionalesen las células normales. Esto requiere una alta especificidad, estabilidad del compuesto, penetrabilidad en la cálula diana y efecto celular letal.
La estructura de la inmunotoxina empezó siendo la inmunoglobulina G (Ig G) completa unida a la toxina por un puente disulfuro. Una vez ya en el interior de la célula el puente disulfuro se reduce liberando la toxina. Un paso adelante lo constituyó la sustitución de toda la molécula de Ig G por una parte de ella. El tratamiento de la Ig G con algunas proteasas, como la "pepsina" o la "ficina", genera fragmentos heterodímeros (Fab')2 y Fab' unidos entre sí por puentes disulfuro. Cada dímero está formado por una cadena pesada (H) y una ligera (L) unidas por un puente disulfuro por la parte constante. Los frgamentos Fab' se pueden unir directamente a toxinas por medio de enlaces disulfuro creados como consecuencia de la reducción de (Fab')2.
La ventaja de Fab frente a la inmunoglobulina G entera es su menor tamaño, lo cual facilita notablemente la penetración en la célula. Los conjugados toxina-Fab' pueden crearse bien por ingeniería genética fusionando a nivel de ADN las regiones que codifican por cada parte, o bien por medio de un enlace químico que una las dos partes in vitro.
Las partes variables de Fab', unidas por un puente disulfuro y que constituyen las Fv-Tx. Sólo se pueden obtener por ingeniería genética fusionando a nivel de ADN las regiones codificantes correspondientes, pero son algo inestables. La inclusión de un péptido de conexión estabilizador en las moléculas recombinantes (Fv cs-Tx) ha solucionado este problema.
La especificidad la da el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales son más específicos que los polivalentes, por estar dirigidos contra una pequeña parte específica de la proteína (epitopo) y no contra su totalidad.
Los anticuerpos deberían estar dirigidos contra las partes específicas de las proteínas que estuvieran en los tumores normales. Por ejemplo, los anticuerpos auténticamente específicos de carcinomas deberían reconocer las formas mutadas de las moléculas que controlan el crecimiento celular pero en sus versiones normales. En la mayoría de los casos no se consigue una especificidad tan precisa y la mejor aproximación son los anticuerpos cuasi-específicos que reaccionan con antígenos que se expresan predominantemente en determinados carcinomas y muy poco en las células normales.
Otros requisitos para que la inmunotoxina sea eficiente son :
| que el antígeno esté en la superficie de la célula , de ahí que se utilicen receptores o carbohidratos de membrana; |
| que el complejo antígeno-anticuerpo se interne eficazmente al citoplasma celular por endocitosis, y |
| que se libere la toxina mortal por reducción de los puentes disulfuro que la unen con la mitad inmunológica. |
Las toxinas que más se utilizan son la ricina, la toxina diftérica y la exotoxina de Pseudomonas. Las tres matan la célula inhibiendo la sínteis de proteínas a nivel de los ribosomas. Son muy eficientes, necesitándose muy pocas moléculas para inactivar todos los ribosomas celulares. Sus genes han sido clonados, caracterizados y parcialmente alterados para mejorar sus propiedades tóxicas. El mayor inconveniente de las toxinas es que pueden reaccionar indiscriminadamente con cualquier célula causando toxicidad inespecífica. Se han conseguido delecciones génicas que eliminan una pequeña región de ADN responsable de la interacción toxina-célula; ello disminuye notablemente la toxicidad inespecífica evitando que toxinas conjugadas o aisladas, puedan causar la muerte de otros tipos celulares.
El efecto antitumoral de la toxina es mucho más rápido ( unos siete días ) que el desarrollo de una respuesta inmunológica seria. Aún no disponemos de la inmunotoxina perfecta que permita matar todas las células tumorales sin producir efectos más o menos deletéreos en el resto del organismo.
La causa principal de estos decepcionantes resultados es que las inmunotoxinas no llegan realmente a todas las células tumorales, particularmente en los tumores sólidos. Los motivos de esta inaccesibilidad son varios: poca vascularización del tumor, una gran presión del fluido intersticial en los nódulos tumorales, presencia de membranas basales envolviendo el epitelio tumoral y ocultamiento de los posibles antígenos antitumorales que deberían exhibirse en las membranas de las células neoplásicas. Todo esto contribuye a que la efectividad de las inmunotoxinas no haya alcanzado aún las espectativas esperadas.
Ciertas moléculas producidas en la célula tumoral pueden convertirse en antígenos de rechazo. Las células tumorales producen al menos dos tipos de antígenos que pueden ser reconocidos por las células T citotóxicas:
| Los productos de los oncogenes, es decir, proteínas aberrantes distintas a las originadas por los protooncogenes y exclusivas de células tumorales. |
| Antígenos tumorales formados por los productos de genes embrionarios que no se expresan en las células normales de adultos. |
Claramente la habilidad para crear respuestas contra antígenos propios específicos de tejido puede ser de gran utilidad para el tratamiento de cánceres derivados de órganos no esenciales como la próstata, pero por otra parte los antígenos específicos de tejido pueden crear problemas de autoinmunidad, que deben ser superados.
Recientemente se han utilizado vacunas trumorales para el tratamiento de pacientes con tumores sólidos. Las estrategias empleadas han sido variadas y los resultados inconsistentes. Sistemáticamente células tumorales irradiadas se mezclaban con diversos coadyuvantes, como el bacilo de Calmette-Guerín, para estimular la respuesta inmunológica. La inclusión de coadyuvantes no pareció incrementar la acción mediada por las células T, pero en algunos casos las células tumorales irradiadas mostraron un rechazo inmunológico. Desgraciadamente, en la mayoría de los casos la magnitud de la respuesta fue pequeña, y no se consiguió erradicar tumores ya establecidos.
Todos los tratamientos de terapia génica que se han descrito están más indicados para cánceres de tipo metastático que primario; dado que aún hoy no se conoce el alcance de la curación, es preferible que los pacientes hayan agotado otros métodos de curación y que los riesgos de la terapia génica sean menores de los derivados de la evolución de la propia enfermedad.
Hay muchos problemas pendientes : cómo transferir de manera estable y eficiente a tumores in vivo; cómo evitar los riesgos de infección vírica en pacientes y operadores; cómo generalizar los tratamientos de terapia génica,...
La eficiencia de toda esta tecnología en la cura de una de las mayores "plagas" de nuestra sociedad es aún ínfima para el numero de trastornos que se ocasionan y a su especial rápidez y avance de la enfermedad. La solución por tanto no es enfocar la respuesta a un único tratamiento terapéutico, sino combinar con diferentes técnicas (quimioterapia, radioterapia, tratamientos farmacológicos de última generación, terapia génica,....) las habilidades de éstos, y preparar mediante estudios detallados y específicos la mejor respuesta al caso. Así, que aún hoy tras decadas de estudio y lucha por curar esta enfermedad , y aunque estos avances resulten ser esperanzadores solo nos cabe preguntarnos si será la respuesta definitiva a tanto tiempo de espera y en muchos casos de impotencia y resignación.
La terapia génica para el HIV está destinada a realizar muchos propósitos. Los propósitos son proteger células no infectadas residuales y eliminar células infectadas. Pero lo que más se intenta es reducir la infección en personas infectadas y evitar la expansión del virus a través de la población.
Haremos un breve repaso del ciclo infectivo del virus a través de estos esquemas:
La mayoría de los procesos del ciclo viral tiene puntos vulnerables que pueden ser desvaratados con métodos genéticos.
Algunos aspectos como son la transcripción y translación son llevadas a cabo por la maquinaria de la célula hospedadora es probable que la inhibición siginificativa pueda llevar a la muerte celular. Procesos específicos del virus son utilizados como puntos de arranque: la entrada en la célula, la transcripción inversa, o la integrción. La interacción entre los ARN tat y rev con proteínas es un punto claramente vulnerable al igual que el empaquetamiento del ARN genómico.
La expesión in vivo de una proteína viral puede ser utilizada como una vacuna genética para atacar al virus. Usando sistemas con virus influenza en modelos animales han demostrado la eficacia de esta vacuna genética, en la cual una inyección directa de ADN plasmídico puro que codifica proteínas virales lleva a una expresión persistente de los genes virales.
En infección por HIV es importante conservar regiones del virus genómico como inmunogénico porque el virus posee gran habilidad de mutación y de evitar respuestas neutralizantes. se ha visto que en pacientes con SIDA que la evasión de la respuesta inmune contra epitopos específicos de las células T citotóxicas pueden ocurrir incluso en porciones relativamente conservadas del HIV, como es el gag. La entrega de genes virales junto a genes que codifcan moléculas inmunoestimulatorias, como la molécula B7/BB1, es otro desarrollo potencial.
El pg160, proteína precursora de la envuelta expresada en células singénicas, está siendo utilizada para inducir respuestas inmunitarias humoralesy celulares en ratones.
Una vez que células que desarrollan la inmunidad expresan la proteína inmunogénica probablemente serán destruidas por contener un virus transcipcionalmente activo. La gran proporción de células infectadas albergando un virus latente persistirá y proveerá un pozo del que emergerán mutantes capaces de evitar la respuesta inmunitaria.
Es por esto por lo que la inmunización con proteínas del HIV sigue siendo muy difícil por no decir casi imposible, al menos con la tecnología actual. Además hay que sumar el hecho de que es un virus con una elevada tasa de mutación, con lo cual la creación de inmunidad para un tipo de producto génico puede verse inútil si el virus cambia por mutación.
ADNs copia de interferones han sido clonados e insertados en vectores para su expresión constitutiva o inducible en células diana. El tratamiento con interferón induce algunas proteínas celulares una de las cuales ( RBP 9-27 ) aparentemente interactúa con la estructura en bucle del ARN que codifica rev y puede inhibir la expresión de proteínas gag-rev dependientes.
Se han desarrollado varias estrategias para que células infectadas por HIV se autodestruyan. La subunidad A de la toxina diftérica (DT-A) está codificada por un gen que puede ser utilizado como un gen suicida inducible. Sólo una pequeña molécula de DT-A puede ser suficiente para matar a una célula. Otros genes letales que se usan incluyen a la timidina quinasa de HSV (tk) , que es inócua al menos que en el medio haya ganciclovir o aciclovir. En caso de la presencia de estos compuestos, que pueden ser fosforilados por la tk ( como ya dijimos en su aplicación en el cáncer ), la célula muere. Otros resultados prometedores se han obtenido usando in vitro la toxina quimérica CD4 de Pseudomonas que mata células que producen el pg120 del virus.
Esta forma de terapia tiene inconveniente que reside en la interacción tat-LTR. El LTR del HIV es un promotor muy promíscuo , que es activado por un gran número de proteínas además de tat, incluyendo factores transcripcionales como los de los citomegalovirus. Hay un control limitado de la expresión del gen suicida inducible por tat, y la destrucción de la célula puede ocurrir bajo otras circunstancias que no sean la infección por HIV.
La interferencia en la replicación viral se puede hacer por interrupción de procesos virales como son la entrada en la célula, o más fácilmente, en la salida, aquí el ADN del provirus no es un objetivo práctico.
Para aumentar la posibilidad de inhibición antes de la integración del HIV probablemente se necesite la producción constitutiva de genes antivirales.
- La interferencia se puede realizar por varios métodos . Uno de ellos es la modificación de la molécula CD4. Bloqueando la molécula CD4 para que el pg120 viral no pueda adsorberse sobre él es una proposición esperanzadora. In vitro se ha visto también que células mutantes para el CD4 no reconocen la glicoproteína de la envoltura del HIV por lo que son resistentes ante la infección del virus. Otra manera sería inyectar grandes cantidades de CD4 en la sangre, pero se ha visto que la dosis requeridapara que sea detectable en el plasma, es más alta de lo esperada.
Otros se realizan utilizando terapia basada en nucleótidos, de los que hay tres clases de ARN antivirales y que son: el ARN antisentido, los ribozimas y el ARN decodificante.
- El ARN antisentido para el LTR de HIV es entregado por un vector AAV, y produce una reducción superior al 90% de las replicación del HIV. Estas moléculas antisentido necesitan estar presentes en más número que su secuencia diana, lo que dificulta su producción y eficacia.
- Sin embargo, los ribozimas, como se regeneran después de cada interacción catalítica no se requieren en gran cantida. Los ribozimas anti-HIV expresados establemente en células HeLa-CD4+ pueden inhibir la replicación del HIV. Este mismo efecto se produce en blancos que posean la integrasa RT y las regiones tat y env.
Proteínas mutantes pueden a veces interferir en la funciones normales. Esto se conoce como fenómeno transdominante negativo , en el que un pequeño número de proteínas mutantes pueden interferir en los efectos de una gran cantidad de proteínas normales. Las proteínas más utilizadas para este experimento son las proteínas tat y rev.
También se ha visto que en mutantes dominantemente negativos de la proteína de la envoltura puede inhibir la producción de HIV, y mutantes dominantemente negativos en el dominio de unión a CD4 pueden reducir la cantidad de CD4 y disminuir la producción del virión.
En teoría se pueden secuestrar algunas proteínas estructurales del virus. El secuestro de una envoltura viral por un CD4 que contiene una señal de retención del retículo endoplasmático, se ha podido ver en varios experimentos . Cadenas sencillas de anticuerpos se han desarrollado para secuestrar la proteína de envoltura en el retículo endoplasmático. La co-transfección de cadenas sencillas de anticuerpos específicos para pg120, también reduce los niveles de partículas HIV infecciosas, sin afectar al nivel de producción de la proteína gag.
Estas metodologías son particularmente sensibles al acercamiento de la terapia génica y parece probable que dentro de los próximos 5-10 años una combinación de terapias, incluyendo agentes farmacológicos y agentes de terapia génica, puedan ser usados en concierto para minimizar la propagación del HIV dentro de un individuo afectado y de este modo prolongar su vida libre de enfermedad. Una vacuna basada en la terapia génica es también una seria posibilidad. El HIV por si mismo puede paradójicamente llegar a ser una valiosa arma terapéutica y la terapia génica del SIDA puede llegar a ser el campo pionero para el desarrollo de acercamientos similares a otros agentes infeccionsos.
El Derecho es un instrumento para configurar la actuación social, y en particular el Derecho Penal debe estar atento a los avances sociales de cualquier tipo y mucho más a los progresos técnicos que sirven para mejorar el sistema de vida de los ciudadanos. Sin embargo, El Derecho reacciona de una forma más lenta a las expectativas que se producen en la sociedad (avances tecnológicos), esta falta de sincronía motiva que a veces existan vacios jurídicos que producen en la cuidadanía una cierta sensación de indefensión.
Algunos avances tecnológicos con fines meramente terapéuticos esconden intereses menos loables como pueden ser el mejoramiento de la especie. Es aquí cuando el ordenamiento jurídico ha de intervenir regulando y protegiendo estos avances.
A la hora de legislar hay que tener en cuenta:
| Las posibilidades actuales, futuras y futuribles de la ingeniería genética. |
| Los riesgos presentes, futuros y futuribles existentes en la manipulación genética. |
| Los principios jurídicos que determinan los límites de licitud de las intervenciones manipuladoras. |
| Los sistemas de control y las técnicas de reglamentación de éstos. |
El esfuerzo del legislador español en dar respuesta a estos interrogantes encuentra su plasmación en la Ley del 28 de Diciembre de 1.988, la cual contiene las autorizaciones, prohibiciones y sanciones sobre la donación y utilización de embriones y fetos humanos, o de sus células, tejidos u órganos con fines diagnósticos, terapéuticos, de investigación o experimentación.
En este punto encontramos a la doctrina dividida, pues distinguimos a un sector minoritario que afirma la suficiencia jurídica de esta Ley, y un sector mayoritario que considera la ya mencionada Ley como insuficiente, reclamando una tutela eficaz de estos bienes a nivel penal.
Basándonos ya en el Código Penal de 1.995, donde se recoge bajo la denominación de "Delitos relativos a la Manipulación Genética" ( Título V del Libro 2º ) desarrollado en los artículos 159 al 162 inclusive, podemos diferenciar dos bloques. Uno el más directamente relacionado con la manipulación genética propia, y un segundo bloque más distante del concepto de manipulación al que afecta, de manera impropia o de ninguna manera.
Por tanto nos centraremos en el primer bloque compuesto por el artículo 159, que protege la integridad de la especie y su normal desarrollo , y el artículo 161 que defiende la intangibilidad del patrimonio genético humano en su apartado primero, y la identidad genética de cada uno de los ciudadanos que integran la especie humana en su apartado número dos.
En atención a este bloque y por contraposición es lógico afirmar que sólo supone una limitación a la manipulación genética, ya que acepta el interés terapéutico de esta aplicación.
Artículo 159. Contempla dos hipótesis diferenciadas por la comisión subjetiva de la conducta:
a) Tipo doloso. Referido al 159.1 del CP. Castiga la manipulación genética realizada de forma voluntaria conociendo de su ilicitud.
b) Tipo imprudente. Referido al 159.2 del CP. La diferencia con el 159.1 está en que la manipulación es lícita (terapéutica), sin embargo, va a ser castigada porque el manipulador infringe los más elementales cuidados profesionales (actuando de manera temeraria).
Artículo 161. Tenemos ahora dos partes diferenciadas:
161.1. Va a castigar la fecundación del óvulo que persigueun fin que no sea la procreación humana.
161.2. Va a castigar la creación de seres humanos idénticos por clonación u otros procedimientos dirigidos a la selecciónde la raza.
Referente a todo esto, el Parlamento Europeo aprobó , el 16 de Marzo de 1.989, la Resolución sobre los Problemas Éticos y Jurídicos de la Manipulación Genética, que recomienda la prohibición de los experimentos destinados a la investigación de laclonación en humanos, De igual forma se pronunció el Consejo de Europa.
Además del delito que supone la manipulación genética, el Código Penal de 1.995 castiga, persigue y sanciona a los resultados originados por la manipulación. Es el caso de los delitos de lesiones recogidos en el Libro 2º, Título III y IV centrado en : las lesiones stricto sensu , en persona , y lesiones producidas a nivel fetal (conocido jurídicamente como nasciturus = el que va a nacer ). De forma más concreta y específica mencionamos el articulado que recoge ambas ideas.
Lesiones stricto sensu: Art. 147, art.148, art.149, art. 150, art.152.
Lesiones al nasciturus: Art. 157, art.158.
Como antecedentes al Código Penal de 1.995 es importante destacar los artículos 420, 421 del Código Penal de 1.973.
En cuanto a la terapia génica en la línea germinal, nos remite a la Ley sobre Técnicas de Reproducción Asistida, que admite la terapia génica (art. 1.3) en embriones y fetos en el útero únicamente si se cumplen ciertos requisitos, entre ellos el de disponer de una lista de enfermedades en las que la terapéutica sea posible desde criterios estrictamente científicos. Dicha lista debe aprobarla el Gobierno de la nación por Real Decreto (disposición final 10,d) siempre que no se influya en los caracteres hereditarios no patológicos ni se busque la sellección de los individuos o la raza 8, art. 13.3c y d, resp.).
Datos económicos indican que los costes de los primeros años de transplantes cardiacos son unos 90.000$ por paciente (dolares de 1.983) en los EEUU, sería razonable preguntarse si la terapia génica será otra tecnología cara a medio plazo. Si se emplea en transplantes de médula ósea, en la terapia génica humana será trabajada intensamente y supondría unos considerables costes iniciales. Pero aún cuando nadie asigna un valor econó,mico en el mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes curados, lo más seguro es que algún día la terapia génica costará considerablemente menos que la hospitalización repetitiva por enfermedades como la anemia falciforme o la fibrosis quística. En breve, para pacientes que sufran alguna enfermedad genética causado por el defecto en un gen, la terapia génica se puede convertir en un método de cura bastante costoso.
En un futuro más lejano, las perspectivas para la terapia génica en humanos todavía no están claras . Pero si se rompiese el eslabón entre el transplante de médula ósea y la terapia génica, ésta se podría aplicar a un círculo de pacientes más extensos. Por ejemplo, si vectores específicos para un particular tipo de célula diana se pudiera desarrollar, la combinación vectro/gen, quizá pueda ser administrada de forma intravenosa. Aeste nivel, si alguna vez se alcanza, la medicina setarás en el umbral de una nueva era para el tratamiento de más de 3.000 desórdenes genéticos que afecten a nuestra especie.
El rango potencial y la versatilidad de la terapia génica han sido perfilados en puntos anteriores de este trabajo. esta es una nueva forma de intervención terapéutica a un nivel molecular, con aplicaciones en muchas áreas del tratamiento médico que engloba desde la corrección de un locus individual de un defecto génico heredado por inmunización, tratamiento de enfermedades infecciosas hasta el cáncer. Esta es también una nueva farmacología. Mientras muchos fármacos corrientes persiguen modificar procesos endógenos por la aplicación de novedosos, compuestos artificiales, la terapia génica reparte un agente biológicamente activo muy específico a un sitio determinado y a la vez con la posibilidad de permanentes, transitorios o inducibles estadosde la expresión. Como un nuevo fármaco debe ser testado en el contexto de la herencia. La heredabilidad requiere dos funciones: primero, la transmisión de la información de generación eln generación, y segunda, la expresión de la herencia.
Transmisión y expresión están separadas a nivel molecular, y , en organismos multicelulares, a nivel celular. La determinación celular va seguida por la diferenciación en un estado temprano que separa irreversiblemente el linaje somático de los portadores potenciales de información a la siguiente generación: las células de la línea germinal. La exprewsión del gen terapéutico puede ser afectada transitoriamente por el uso de vectores que no se integran o por células diana con una vida biológica limitada. Si, como es normal, la expresión es requerida a largo plazo, deberemos usar vectores que se integren o autoreplicativos. Estos son más difíciles de distribuir y controlar.El material genético en un cromosoma está influido directamente por partes del genoma cercanas y distantes que actúan en cis y trans. Esto no es una sorpresa ya que uno de los mayores problemas con la transferencia génica como práctica corriente es la expresión a largo plazo del gen transducido cuando la transferencia se produce en secuencias mínimamente contextuales. La familia del gen de la globina lo ilustra bastante bien. El control de la expresión depende de cuatro regiones distantes aguas arriba reconocidas por su hipersensibilidad ADNasa I y se les llamó regiones para el control del locus (LCRs). Aún con estas regiones incluidas la transferencia del gen de la globina era imprescindible ya que se podía reorganizar de diferentes maneras.
¿Cómo podemos solventar este problema? En principio se comenzó a "limpiar" la construcción de motivos de interferencia extraños por esacaneo de las secuencias del vector que actuaban como señales cis, las cuales podrían ser las responsables de las distintas formas de reorganizar, y se intentó posteriormente eliminarlos sistemáticamente por delección o por mutación puntual dirigida.
La sustitución por un gen anormal o no funcional por recombinación homóloga es una segunda posibilidad, y teóricamente, la forma ideal de terapia génica. Hasta ahora esto se ha ido practicando sucesivamente en líneas celulares o en células stem embrionarias de animales. La confianza que nos proporciona los procesos celulares endógenos para la recombinación son insatisfactoriamente bajos. Sin embargo, desde hace años se conocen
enzimas que catalizan la escisión e inserción de material genético por reconocimiento de una secuencia nucleotídica particular, esto es lo que se está usando en la transferencia de genes eucarióticos. El sistema mejor conocido es el sistema cre/loxP de los bacteriófagos. La enzima cre reconoce una secuencia oligonucleotídica particular y corta una pieza de material genético existente entre dos deesas secuencias, y después ligará los extremos del material genético cortado. Las secuencias que cortan las enzimas se llaman loxP. Introduciendo sitios loxP se crean sitios de inserción y delecciones específicas en células stem embrionarias.
Una tercera posibilidad es intentar transferir una unidad genética grande que contenga el gen y todo la unidad llevará asociada regiones de control junto a genes accesorios en un formato autorreplicativo. A esto se le llama cromosoma artificial , y que nos supera las limitaciones en el tamaño del ADN que puede ser transportado a base de vector. Esto se ha demostrado utilizando vectores YAC (cromosoma artificial de levadura) para crear ratones transgénicos. Los cromosomas artificiales también evitan los problemas en el control del sitio de integración del ADN exógeno. Los centrómeros y telómeros de levadura parece que no son funcionales en células de mamíferos por lo que el objetivo más corriente sería la producción de vectores de cromosomas artificiales que lleven los centrómeros y telómeros que combinen la habilidad de transportar grandes piezas de ADN (varios cientos de kilobases), con la capacidad de segregación com un cromosoma independiente en sincronía con el genoma del hospedador en la célula en división.
Por último,varios sistemas están siendo explorados para el reparto de hormonas, factores de coagulación, anticoagulantes, y otros agentes terapéuticos. Cuando sus genes estén introducidos dentro de fibroblastos o células del endotelio vascular, sus productos pueden ser detectados en sangre durante diversos períodos de tiempo. Estudios recientes en ratones sugieren que mioblastos pueden ser particularmente ventajosos como células diana para el reparto de proteínas recombinantes. Transferencia génica in vitro seguida por el reinjerto de las células está siendo explorado para restaurar funciones de enfermedades crónicas del sistema nervioso. Si se consigue probar como efectivo tales técnicas de implantación combinadas con los genes transfectados podrían ofrecer un nuevo camino de tratamiento para desórdenes crónicos tales como el Parkinson o la enfermedadad de Alzheimer.
En otoño de 1.998, French Anderson uno de los pioneros de la terapia génica propuso una solicitud de aprobación de un protocolo para el estudio de la terapia génica in utero. Anderson se propone tratar dos enfermedades genéticas muy graves; la alfa-talasemia, enfermedad fatal de la sangre, debida a un defecto del gen de la hemoglobina, y una deficiencia inmunitaria grave, SCID (Severe Combined Inmune Deficiency), resultado de la carencia de un gen esencial, el del enzima adenosina desaminasa (ADA).Se propone ensayar el métido en fetos portadores de estas anomalías genéticas, cuyas madres hayan decidido abortar. Sólo después de la interrupción del embarazo podrán los investigadores verificar la eficacia del tratamiento. Todavía se necesitarán de dos a tres años de trabajo en vectores y de ensayos en el animal para que estos proyectos sean técnicamente aceptables. Si la terapia génica in utero se revela eficaz, el principal problema ético que, con el tiempo,suscitará este tipo de intervención en el feto será el riesgo de modificación de las células del grupo germinal, precursoras de las células sexuales y, por tanto, del patrimonio genético que se transmite a la descendencia. Ahora bien, la prohibición de la terapia goza de consenso. El proyecto de convención de bioética del Consejo de Europa, por ejemplo,excluye tal posibilidad. Incluso del RAC (Recombinant Advisory Committee), órgano del National Institutes of Health (NIH).
La modificación del material genético de una célula afecta tanto a la célula como a sus descendientes. Hay un gran debate de los peligros potenciales del uso de un tratamiento que diseña deliberadamente cambios genéticos que son potencialmente propagables.
Estos miedos se centran sobre todo en las alteraciones genéticas de la línea germinal. Se cree que los riesgos de estos tratamientos. Pero, ¿cuáles son estos riesgos?
Todas las integraciones cromosómicas, aparte de los cambios homólogos, poseen el potencial de alteración de locis endógenos fortuitos y por lo tanto producir mutagénesis, que puede derivar en oncogénesis.
Si realizamos la terapia génica en células somáticas nosotros no transmitiremos los genes manipulados en esas células somáticas a las futuras generaciones pero alteramos la línea genética del individuo. La intervención directa en las células somáticas difiere del tratamiento médico convencional sólo en que aquí hay una clara y directa conexión entre la terapia y la selección genética.
En el caso de síndromes causados por locis dominates el conjunto completo de genes está representado por los individuos afectados. Su éxito reproductivo por lo tanto influye directamente en el tamaño de este conjunto en la siguiente generación. Si los individuos llevan alelos no reproductivos, la fecuencia del gen en la población está mantenida por que ocurran nuevas mutaciones.
En las enfermedades genéticas ligadas al sexo, recesivo en la mujer y dominante en el hombre. Como el número de afectados es mucho mayor (todos los machos que lleven el alelo se verán afectados) la influencia del éxito de la terapia en la frecuencia génica será también mayor.
La modificación deliberada de la línea germinal tendria efecto sobre la estructura de la población sólo por una transformación genética a gran escala o alternativamente donde el genoma mutado tenga una alta ventaja selectiva. Un hecho preocupante sería la introducción de resistencia a una enfermedad patógena. Si sólo "los elegidos" son protegidos de la enfermedad podrái existir la posibilidad de un gran cambio genético en la población ¿Sería la terapía génica en la línea germinal realmente necesaria? La terapia génica somática, tiene un efecto directo sobre el paciente individual pero alguna transformación géncia de la línea germinal puede sólo tener efectos sobre la descendencia aún no nacida. Esto por lo tanto no afectará al paciente que eatá siendo tratado. Con las posibilidades de investigación de prenatales de la preimplantación tanto como de la donación de esperma y óvulos y adopción es muydifícil ver como la intervención deliberada en la línea germinal puede ser éticamente justificable. No obstante esta idea será más profundizada en el siguiente apartado, sobre la ética en la terapia génica.
El hecho de que la terapia génica sea una tecnología minuciosa, con dificultades técnicas, muy lenta y no menos potencial como arma terapéutica en la cura de muchas enfermedades, hizo apostar desde el principio en este campo a la mayoría de las empresas de biotecnología y grandes grupos farmaceúticos. Actualmente estas empresas invierten millones y millones de dolares en este mercado.
En Marzo de 1.998, Transgène empezó a cotizar en la bolsa de Estrasburgo. Su cotización simultánea en el Nasdaq y el Nouveau Marché (mercados bursátiles norteamericano y francés, especializados en valores de alta tecnología y de crecimiento), le permitió ganar 613 millones de francos (unos 15.000 millones de pesetas ).
Fue a partir de los 90 cuando se produjo el alza en estas empresas cuando entraron bolsa llegando a ganar no menos de 174 millones de dólares ( unos 24.000 millones de pesetas ) entre 1.993 y 1.995. Así , los grandes grupos farmaceúticos empezaron su inversión en estas nuevas empresas llegando incluso a comprar compañias enteras o a fusionarlas. Por ejemplo, en 1.995 se compraron por 729 millones de dólares ( más de 100.000 millones de pesetas ) cuatro sociedades de terapia génica: Rhone-Poulenc adquirió Applied Inmune Sciences, Sandoz (que se fusionaría más adelante con Ciba para dar Novartis ) compró Genetic Therapy Inc. (GTI), Chiron (que posteriormente sería adquirida por Ciba y se integraría por lo tanto en Novartis) se hizo con Viagene y Schering Plough compró Canji.
Pero tras el informe publicado por los Intitutos Nacionales de Salud (NIH) sobre los resultados sobrevalorados y la eficacia clínica de los protocolos se produjo una gran caida en bolsa de estos grupos. Salvo los grandes grupos farmaceúticos que por su potencia financiera aguantaron el generalizado descalabro. La mayoría de las empresas "pequeñas" de terapia génica no lograron ganar más de 69 millones de dólares ( unos 10.000 millones de pesetas ) desde el final de 1.995 hasta la primavera de 1.998. Mientras empresas farmaceúticas aprovechaban el bache de otros para invertir en 10 años unos 800 millones de dólares (más de 110.000 millones de pesetas ).
Debido a que los productos de terapia génica son el resultado de la unión del gen y un vector encargado de transportarlo (en la mayoría de los casos), el objetivo de todas estas empresas era adquirir el dominio en estos dos componentes bajo objetivos de rentabilidad como factor común. Aunque actualmente la terapia génica no tiene una consistencia suficiente para determinar cuál será la tecnología de transferencia que se impondrá a las otras. Se supone que en el futuro no habrá una tecnologíadominate sino diferentes métodos según el tipo de patologías tratadas, el órgano implicado, y eventualmente las características del gen. Esto implica que las empresas no pueden invertir todos sus esfuerzos en una sola aplicación, sino tomar o disponer de una base tecnológica lo más amplia posible.
Así por ejemplo, empresas como Transgène tienenacceso tanto a vectores virales y no virales. Haciendo más incapié sobre estos últimos, pues en palabras de Bernad Gilly, director de Transgène, " a largo plazo el futuro pertenece sin duda a los vectores no virales, pero todavía queda mucho trabajo por hacer antes de que sus rendimientos les permitan competir con las cualidades de los vectores virales".
Además, las empresas de terapia génica tienen que acceder a los genes. Esto plantea un nuevo problema en este duro mercado, pues la mayoría de los genes importantes están patentados y su acceso o su licencia es sumamente costosa económicamente. Así las diferentes empresas han ido abriéndose camino en el mundo de los acuerdos y licencias. Por ejemplo, Transgène tiene un acuerdo con Human Genome Sciences (HGS) una de las empresas con los mayores bancos de genómica funcional (estudio sistemático de la función de genes descubiertos, además de su estructura) . Este acuerdo le da a Transgène una licencia exclusiva para un número máximo de 10 genes seleccionados del banco de datos de la empresa norteamericana. Así Transgène tiene acceso durante 10 años por unos 4000 millones de pesetas, invertidos en forma de una participación del 10% de su capital.
Por otro lado Cell Genesys espera basar su política en la patente de los genes descubiertos por sus equipos y en adquirir licencias de los que han sido descubiertos en los laboratorios públicos. Novartis por su parte accede a los bancos de Incyte, además está invirtiendo 250 millones de dólares durante 10 años en su propio centro de genómica funcional en La Jolla (California).
En cuanto a la reglamentación de los protocolos son diferentes según sea en EEUU o en Europa, debido a que en Europa hay más limitaciones y mayor grado de exigencia.Aquí la terapia génica está encuadrada en dos directrices, una sobre el confinamiento y la otra sobre la diseminación de Organismos Genéticamente Manipulados (OGM). Actualmente en revisión por el Parlamento Europeo.
En cuanto al confinamiento, la nueva versión parece que se orienta hacia una cierta simplificación. Aunque esto depende mucho de los países. Más rigurosos en Bélgica y Francia, por ejemplo, que en Gran Bretaña.
Por lo que respecta a la diseminación de OGM, su revisión europea parece preveer un reforzamiento de las restricciones a la utilización de productos de terapia géncia.
No es por tanto casualidad que una aplastante mayoría de pruebas clínicas se realicen en EEUU. Tanto más cuando que en Europa, aunque el registro de los productos surgidos de las biotecnologías corresponde exclusivamente a la Agencia Europea del Medicamento, la reglamenteación de pruebas clínicas se deja a cada estado, lo que no simplifica el proceso.
Desde la ultima primavera se viene preparando en Europa una directiva con una reflexión específica sobre la terapia génica, que tendría que permitir una armonización.
En un futuro las empresas de terapia génica que logren un día comercializar sus productos no serán sólo las que habrán sabido poner a punto los productos más seguros, ofreciendo la mejor relación calidad-precio, sino también las que habrán establecido la mejor estrategia de propiedad y patente.
Así, este derecho a patentes y a diversos trabajos e investigaciones garantizan tanto una batalla legal como una batalla contra el tiempo, por encontrar los mejores genes, vectores y técnicas de transferencia. Lo que a menudo en vez de ser un incentibo a la hora de acortar la espera a nuevos descubrimientos, roza tintes mercantilistas y rastreros. Ya que si una empresa posee cierta información, no es que sea reticente a compartirla, sino que en la mayoría de los casos se niega a ninguna publicación de su trabajo para por un lado, evitar plagios, y por otro sacar jugo económicamente a su descubrimiento. No podemos entender como algo tan universal como es la salud personal, puede ser motivo para crear increíbles fortunas y enrriquecimiento a unos pocos. De ahí el título del apartado, "el negocio de la salud", pues debajo de todo este montaje, de buscar soluciones a tantas enfermedades, se esconde el instinto egoísta, materialista y podrido de ciertos grupos que se denominan "farmaceúticos", que en vez de aportar ayuda lo que hacen es limitarla, entienden la salud como un privilegio más que como un derecho. Cómo se puede jugar con la salud de la gente tan vilmente. No rechazamos que este tecnología es cara y necesita de un personal y unas infraestructuras al alcance de muy pocas empresas, y que sus productos en la mayoría de los casos, y tecnológicamente hablando, son grandes obras de ingeniería genética. Pero la razón para que estos productos que son la salvación para tanta gente se vean retenidos y filtrados, dirigidos, y en la mayoría de las veces concebidos, para gentes de clase alta capaces de costearlos, o en países capaces de poder distribuirlos, roza los más internos sentimientos de crueldad. Recordemos que para mucha gente es el vil metal lo que mueve el mundo, para ellos no hay gloria sin dinero.
Sin irnos más lejos, merece mención el caso del Dr. Manuel Elkin Patarroyo que ha donado su vacuna sintética contra la malaria a la Organización Mundial de la Salud (OMS). Sin beneficios, ni lucro, cuando podría haberla vendido por una gran cantidad a tantas empresas farmaceúticas que le presionaban por la patente. Hechos como éste son los que refuerzan la idea de que el hombre tiene, a veces, en sus manos el poder para salvar vidas, y debemos aprender a repartirlo equitativa y solidariamente en beneficio de todos.
Si analizamos el concepto de ética, nos encontramos con que es "la parte de la Filosofía que trata la moral y las obligaciones del hombre". Cabe preguntarnos qué cuestiones morales y obligaciones hacia el hombre surgen como resultado de la terapia génica. Durante todo este trabajo hemos mantenido un tono meramente descriptivo de la tecnología de la terapia , sin asomarnos a estas obligaciones y moral de la que hablábamos antes.
La terapia sea génica o no, surge para "readaptar", volver al individuo a un estado "normal", un estado saludable. Así, lo primero que nos debe sugerir este comentario es que, el fin último de la terapia génica debe ser ayudar, reanudar en el individuo una vida normal
en la que pueda seguir con un ritmo cotidiano al igual que lo llevaba antes de sufrir la enfermedad. Sigue así un principio Aristotélico sobre la búsqueda de la Felicidad.En este caso la Felicidad encarnada en el término de salud. Es la antigua lucha del hombre sobre las dificultades hacia su nivel de Felicidad, el interminable camino hacia un destino próspero.
Pero no nos deviemos del enfoque inicial, ¿ por qué una ética? ¿Cuáles son las obligaciones del hombre? Recordemos que en ese viaje, en ese caminar a "lomos" de la terapia génica viajan valores menos puros, más , si cabe decirlo, mundanos y oscuros. Es el riesgo de que no consigamos llegar a ayudar, sino esconder tras esta ayuda motivos crueles y perversos sobre acciones que moralmente son despreciables. Lógicamente son estas ideas las que nos desvían de nuestro camino solidario. Son estos instintos internos, nuestra otra cara, la que lucha por vencer nuestra conciencia y ética y adueñarse de nuestra voluntad.
¿Pero quiénes o qué son esas voces profundas que tantas veces nos tientan? La terapia génica es un instrumento muy poderoso para que sea utilizado con ideas distintas a las de su concepción.
¿Quién nos dice que al aplicar esta tecnología no se "despertarían" alelos defectivos o deletéreos? En un individuo hay multitud de genes reprimidos, algunos de ellos letales, encerrados como en una "caja de Pandora" esperando una oportunidad para librarse de su prisión. El riesgo de estos tratamientos está en su aplicación a nivel genético, con lo cual sin un control y especificidad adecuada podrían despertar esos genes dormidos o librarles de su represión. Actuarían "devastando" áreas de nuestro organismo, adueñándose del control celular y finalmente acabando con la vida del individuo. Así, ¿ quién nos dice que esto no ocurrirá? ¿Sabemos realmente si esto es sólo una utopía?
Del mismo modo, cabría preguntarnos, ¿ los nuevos productos de la terapia génica tendrían características antigénicas? Esto quiere decir, que si una vez formada la nueva proteína resultante del tratamiento, daría una reacción inmunológica en el individuo por autoinmunidad pudiendo llegar incluso a la muerte. ¿ Son suficientes los estudios previos para llegar a conclusiones que permitan determinar estos efectos o nos estamos precipitando?
En el caso de vectores virales, ya sabemos que hemos eliminado su potencial infectivo y destinado a su servicio terapéutico. Pero, ¿estamos completamente seguros que no pueden reaparecer estas características? ¿Estamos seguros que los tenemos perfectamente controlados? Si lo pensamos fríamente llegamos a ideas muy poco esperanzadoras. ¿Creemos que el hombre con su tecnología puede "domesticar" a organismos que tras varios millones de años de evolución han creado mecanismos de escape tan maravillosos y efectivos que cabe pensar en una suprema "inteligencia molecular" ? Un virus capaz de sobrepasar barreras, de luchar eficientemente en "guerra armamentística" con su hospedador, en que la evolución le ha dotado de múltiples mecanismos para superarse a sí mismo, ¿ cómo la arrogancia del hombre llega hasta afirmar un control absoluto en una casi perfecta máquina de la naturaleza? En la famosa novela "Parque Jurásico" hay una frase que desarrolla esta idea, " la vida siempre encuentra un camino". Estos virus forman parte de una unidad podríamos llamarla, multifuncional, no importa que unos caigan, los que queden pueden mutar, recombinarse genéticamente, ser seleccionados creando una nueva estirpe más fuerte, más efectiva, más resistente.
Podemos ganar una batalla, pero la guerra sigue, y sin embargo alardeamos de un control, de unas cadenas que en cualquier momento pueden ser rotas. Es el tan repetido hecho de dominación por el hombre, pero ahora a nivel microscópico. Aún creemos que somos los reyes de la Creación, que somos el último peldaño en la escalera de la Evolución. Nuestra visión antropocéntrica nos ciega en hechos que no tienen validez absoluta. Quizás los tengamos retenidos ahora, pero seguro que no por mucho tiempo. Pronto se librarán de sus "grilletes" y seguirán sus ciclos infectivos ,ahora alterados, pero con el mismo fin de siempre desde hace millones de años, perpetuarse.
De otro lado, hemos dotado a la producción de los tratamientos de un control, de una regulación. Pero, ¿son señales propias las que inducen su elaboración? ¿ Su eficacia es constante? ¿Son fiables? De nuevo nos topamos con una extensa área sin descubrir, no conocemos mucho de la regulación en eucariotas y sin embargo, podemos "jugar al mecano" dando construcciones que luego probamos para ver si da resultado. Y aún así, ¿quién nos dice que un resultado favorable no se deba a otro tipo de interacciones celulares? ¿Qué resultado celular tendría esto? Basamos la eficacia en nuestra construcción, y sin embargo es completamente falso. Creemos que es una imprudencia el aplicar tratamientos que cabría denominarlos de "hipotéticos", pues realmente desconocemos todas sus implicaciones. Y lo más grave, ¿quién nos dice que a largo plazo esto no pueda ocasionar mutagénesis o alterar otras funciones celulares o alteraciones en el ADN a gran escala? Seríamos emisarios de la fatalidad al calificar como terapéutico algo que más tarde alteraría la salud o incluso destinaría irremediablemente a modificaciones, cáncer o muerte a muchos pacientes, por el mero hecho de que no conocíamos todas las respuestas a tantas preguntas. Esperemos que esto no pese en nuestras conciencias por ser cómplices sumisos y callados de un descalabro evolucional.
Destacar también el riesgo en la terapia génica en la línea germinal. El hecho de que se produzca mutagénesis, recombinaciones u otros procesos en terapia génica somática no deja de ser, aún después del daño al paciente, un duro revés. Pero aún así el daño está retenido en el individuo, no se expande. Caso contrario es la terapia en línea germinal. Aquí cualquier modificación del repertorio genético se transmitirá a las sucesivas generaciones. ¿Estaremos modificando así la especie? Bajo nuestro punto de vista y aún después de los beneficios terapéuticos no nos cabe otra respuesta y es que sí. Los nuevos descendientes serían genéticamente distintos a nosotros, y es aquí donde surgen multitud de preguntas, ¿serían considerados individuos de una nueva especie? ¿Tendrían los mismos derechos y obligaciones? ¿Tendrían la misma dignidad que los demás humanos?...
Es en nuestra opinión algo muy grave. El hombre en su evolución ha ido cambiando su patrimonio genético por medio de mutación, selección, migraciones,... y todo bajo la dirección de una Selección Natural que filtraba, cribaba a los "mejores", los más adaptados. Así, el patrimonio genético ha ido alcanzando rangos más complejos y predestinados por la Evolución. Sin embargo,ahora el hombre pretende manipular genes en los nuevos descendientes, adquiriendo un papel supremo, obteniendo una categoría en la cual su aplicación perdurará en el tiempo. Cabe preguntarnos, ¿es necesario una terapia génica en la línea germinal? ¿ Estamos engañando cuando queremos decir terapia génica? La respuesta a la primera pregunta es de difícil solución. El saber que un nuevo hijo nacerá enfermo si no se le aplica la terapia o incluso nacerá muerto, no cabe más respuesta que la de aprobación al método terapéutico. El amor a un hijo prevalece frente a los riesgos a correr.Pero apartando este hecho , ¿quiénes somos nosotros para tomar el mando? ¿Quiénes somos nosotros para obrar y "jugar a ser Dios", para crear nuevas especies? Y es aquí donde recordamos una frase ya expuesta sobre la peligrosidad del maluso de la terapia génica. Bajo la clasificación de terapia se incluirían protocolos para "crear" niños con ventajas adaptativas, sería entonces un mejoramiento de la especie. Una nueva raza de "superhombres" creados con fines oscuros, daría lugar a una nueva forma de marginación social, "la marginación genética" de los menos adaptados.Desarrollaríamos hombres a nuestro antojo, adaptados a diversas condiciones, con oculto destino. Esto sería una de las mejores armas creadas por el hombre. ¿ Cuál sería el límite? ¿Hasta donde deberíamos manipular? Estamos llegando al borde del precipicio y no deseamos parar. ¿ Hemos matado a la Selección? ¿Nos hemos colocado su corona y la hemos desterrado? Quizás no, quizás sea de nuevo la arrogancia, el poder que creemos tener, algún día todo se volvería contra nosotros, pero hasta entonces quizás ya hubieramos acabado con nuestra especie. En palabras de Hobbes, " el hombre es un lobo para el hombre". Nuestra necesidad de conocer todo, nuestra curiosidad nos lleva a veces a indagar en terrenos en los que nunca deberíamos haber entrado, leímos el aviso pero lo ignoramos, y justificamos conductas perversas con la careta de que su fin será solidario. En verdad, que nuestro ansia de conocer, controlar y dominar no tiene límites y eso será nuestra perdición. Como dice French Anderson, " el concepto de mejoramiento de la especie es un ejemplo de una pendiente resbaladiza, una vez que te embarcas es muy duro parar".
Ya dijimos en el anterior apartado que la salud es un derecho universal. El hombre es el único animal que además de su propio "armamento", su inmunidad creada por la Naturaleza, ha conseguido mediante la medicina atacar, perseguir y eliminar las enfermedades que nos han ostigado. Pero, si recordamos uno de los principios básicos de la teoría de la Selección Natural, " los más adaptados son los que sobreviven". Esto provocaba que el resto moría o no se reproducía, con lo cual la especie era "purificada" genéticamente. Ya que sólo participaban para la nueva generación los genotipos más adaptados.El hecho es que el hombre al aplicar tratamientos sobre individuos enfermos ha "rescatado" personas no adaptadas, y así se ha acumulado un lastre que arrastra la especie humana. Los realmente elegidos se han visto diluidos en el conjunto de la población. La especie se ha vuelto heterogénea, mixta, donde conviven individuos "rescatados" e individuos "adaptados". Lógicamente el hombre no puede permitir seguir las leyes de la selección al dejar morir a los menos adaptados, pero esto plantea un problema, ¿llegarán a perderse una gran cantidad de individuos "rescatados" en el futuro? ¿El que la especie no sea uniformemente adaptada traerá consecuencias evolutivas? Aún no podemos responder a estas cuestiones, pero si en nuestras manos está el ayudar a una persona, sin duda correremos el riesgo.
Como conclusión y dejando un poco la ética, pensamos que aunque al valorar los beneficios y los riesgos de los tratamientos los datos no nos hagan estar de acuerdo con su aplicación, la impotencia, la angustia y el dolor por ver como seres queridos se mueren sin poder auxiliarles nos obliga a saltar barreras en nuestra concepción de lo éticamente justo para soñar, con que si al menos pudimos ayudarles en llegar a esa Felicidad utópica de la hablabamos al principio, nuestra Felicidad la abremos alcanzado.
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Miguel Moreno: aspectos éticos y sociales de la terapia génica
| A los profesores Antonio Luis Extremera y Enrique Iañez por su desinteresada ayuda a la hora de proporcionar articulos bibliográficos de este trabajo y algunas direcciones de internet. |
| A Juan Manuel Gabella González por su inestimable ayuda en el apartado de " la terapia génica en el plano jurídico". |
| A Rafael Nisa Martínez y Francisco Pérez Fernández. |
