Mutaciones en procariotas

ÍNDICE:

1      INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO

2      MUTACIONES ESPONTÁNEAS.  

2.1        MUTACIONES PUNTUALES

2.1.1    BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

2.1.2    CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

2.2        MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA [“FRAMESHIFTS”]

2.3        GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS)

2.4        INVERSIONES

2.5        TRANSLOCACIONES

2.6        DUPLICACIONES EN TÁNDEM

2.7        MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES

2.8        REPASO DE CONCEPTOS ÚTILES EN EL TRABAJO CON MUTANTES BACTERIANOS

3      CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

4      TASA DE MUTACIÓN

5      REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

5.1        BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS

5.2        BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS

5.3        EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES

6      AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES

6.1        AGENTES FÍSICOS

6.1.1    RADIACIÓN UV

6.1.2    RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

6.2        AGENTES QUÍMICOS

6.2.1    ANÁLOGOS DE BASES

6.2.2    AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES

6.2.3    AGENTES ALQUILANTES

6.2.4    SUSTANCIAS INTERCALANTES

6.2.5    AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE BASES

7      LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE CARCINOGÉNICAS (TEST DE AMES)

8      ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1        TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1.1    MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS COLONIAS

8.1.2    MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

8.1.3    MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

8.1.4    MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS FUENTES DE C Y ENERGÍA

9      VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS

INTRODUCCIÓN GENERAL A LOS SIGUIENTES TEMAS: VARIACIONES BACTERIANAS ASOCIADAS A CAMBIOS EN EL GENOTIPO

            Los diversos cambios morfológicos, estructurales y funcionales ocurridos a lo largo de la evolución de los seres vivos tienen como base los cambios en los genotipos, que esencialmente pueden ser de dos tipos:

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mutaciones. A pesar de que el mecanismo de la herencia genética es fiel y tiende a la conservación, esta fidelidad no es absoluta e inflexible. Las mutaciones son cambios bruscos ocurridos en el genotipo, y que son transmitidos a las generaciones siguientes.

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recombinaciones subsiguientes a intercambio genético. En la mayoría de los eucariotas, pueden ocurrir recombinaciones entre genotipos individuales de una misma población. En los fenómenos de sexualidad se origina una variedad casi infinita de nuevas ordenaciones o genotipos, sin necesidad del aporte de nuevas mutaciones. Ello suministra una materia prima sobre la que puede actuar la selección, de modo que las poblaciones pueden ir evolucionando con el paso del tiempo, en función de presiones ambientales.

¿Qué ocurre en bacterias?

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Los procariotas son organismos con tiempos cortos de generación: se reproducen rápidamente y pueden dar origen en poco tiempo a grandes poblaciones. Por supuesto, experimentan fenómenos de mutación, por lo que las poblaciones pueden acumular gran número de mutaciones. Estudiaremos la mutación (y los modos posibles de su eliminación) en el presente capítulo.

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Pero la mutación no es el único tipo de variación genotípica en bacterias. Aunque los procariotas carecen de fenómenos de sexualidad auténtica, existen variaciones genéticas asociadas a la adquisición por una bacteria de parte del material genético de otra bacteria o de un bacteriófago. Los posibles mecanismos de transferencia de información genética entre bacterias son:
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transformación (que estudiaremos en el capítulo 17);

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conjugación (ver capítulo 18);

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transducción (ver capítulo 19).

Los fenómenos de recombinación genética asociados a la transferencia serán abordados en la primera parte del capítulo 17.

1     INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO

Definiciones básicas:

            Desde un mero punto de vista fenotípico, mutación es la aparición brusca y espontánea de una variación fenotípica de un individuo, la cual se transmite hereditariamente a la progenie.

            Pero tras el descubrimiento del ADN como material de la herencia, podemos plasmar una definición más ajustada, desde el punto de vista genotípico Mutación es cualquier alteración de la secuencia de bases de un segmento de ADN correspondiente a un gen o a un locus (sea éste transcribible o no), aun cuando esta alteración no se refleje en forma de cambio fenotípico observable o detectable.

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 Alelo es cada una de las distintas versiones en que puede presentarse un gen.
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  alelo silvestre: “forma” (secuencia) de un gen en las bacterias aisladas de su hábitat natural (estirpes silvestres). En la naturaleza es muy frecuente la existencia de polimorfismo:existen diversos alelos silvestres diferentes para un mismo locus.

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alelos mutantes: las distintas “formas” (secuencias) que resultan de mutaciones del alelo silvestre.

Una pareja de conceptos que también conviene incluir aquí es la diferenciación entre mutaciones espontáneas y mutaciones inducidas:

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Mutaciones espontáneas: son resultado de la actividad normal de la célula, o de sus interacciones con su medio natural. La mayoría aparecen por errores en los procesos de replicación, reparación o recombinación del ADN. (O sea, para abreviar, serían aquellas mutaciones no provocadas de forma experimental).

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Mutaciones inducidas: aquellas provocadas por previa alteración experimental del ADN, bien sea directamente, o indirectamente, por agentes físicos o químicos denominados mutágenos.

2          MUTACIONES ESPONTÁNEAS.

Los principales tipos son:

1)      Mutaciones puntuales: sustituciones de pares de bases. Pueden ser:

a)      transiciones: suponen cambio de una pareja Pu:Py à Pu:Py;

b)      transversiones: cambio de una pareja Pu:Py à Py:Pu.

2)      Mutaciones por desplazamiento de la pauta (=fase o marco) de lectura [“frameshift”]. Se deben a:

a)      eliminación de uno o un corto número de nucleótidos;

b)      incorporación de uno o un corto número de nucleótidos.

3)      Grandes delecciones (o borraduras)

4)      Inversiones

5)      Traslocaciones

6)      Duplicaciones en tándem

7)      Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genéticos transponibles.

Los estudiaremos a continuación, comentando algo sobre su base molecular.

2.1        MUTACIONES PUNTUALES

            Las transiciones suponen cambios de una pareja purina: pirimida a otra purina:pirimidina:

A:T ßà G:C

Las transversiones suponen el cambio de un par purina:pirimidina a una pirimida:purina (o viceversa):

A:T ßà T:A

G:C ßà C:G

2.1.1        BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

2.1.1.1       Base molecular de las transiciones

            Se deben, en esencia, a la ocurrencia espontánea, durante la replicación, de formas raras tautoméricas de las bases nitrogenadas. Los desplazamientos tautoméricos del protón cambian las propiedades de formación de puentes de H, de tal modo que:

forma tautomérica

Se comporta como

A* (imino)

G

G* (enol)

A

C* (imino)

T

T* (enol)

C

Por lo tanto, los emparejamientos propiciados por las formas tautoméricas serían:

A* : C

C* : A

T* : G

G* : T

2.1.1.2       Base molecular de las transversiones

(Modelo de Topal & Fresco:observen en el gráfico los emparejamientos de las formas sin y anti)

El modelo predice que la frecuencia de mutaciones puntuales en un par de bases dependerá de:

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constante de equilibrio (k) de tautomerización del par de bases (unos 10-4 - 10-5);

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frecuencia de dNTPs en forma sin. (G sin aparece con frec. de 10-1, A , con 5·10-2).

De este modo, teóricamente deberían darse las siguientes frecuencias de mutaciones puntuales:

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frec. prevista de transiciones: 10-4 - 10-5

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frec. prevista de transversiones: 10-5 - 10-6 (para la G) y 5·10-6 - 5·10-7 (para la A)

            Sin embargo, en la realidad, las frecuencias observadas son mucho más bajas (del orden de 10-10). Esto implica que debe de existir un sistema que corrija los emparejamientos erróneos: como ya sabemos, las ADN polimerasas poseen una capacidad correctora de pruebas (“editing”): cada paso de elongación es seguido inmediatamente por una comprobación del emparejamiento. Si este emparejamiento es erróneo, la polimerasa usa su actividad exonucleasa 3'à5' para elimininar la base mal emparejada, y a continuación vuelve a polimerizar en el mismo lugar (por su actividad polimerasa 5'à3').

Ejemplo: Durante la replicación puede ocurrir que la citosina pase a su forma imino, que se empareja con la adenina:

1)      C à Cimino : A (la A es incorporada por la ADN polimerasa)

2)      Ahora la Cimino vuelve rápidamente a su forma normal, con lo que queda…

3)      C : A (este emparejamiento anómalo es detectado por la polimerasa)

4)      La actividad exonucleasa 3'à5' elimina la A recién incorporada

5)      Vuelve a intervenir la actividad polimerasa 5'à3', que incorpora G

6)      El resultado final es el emparejamiento correcto C à G

             De esta forma, la tasa real de transiciones a partir de una C es aproximadamente equivalente al cuadrado de la correspondiente cte. (k) de tautomerización.

            Parece ser que en la naturaleza existe una selección natural que propicia una frecuencia baja, pero no nula, de errores durante la replicación. El significado biológico es que de esta forma se combina una alta tasa de fidelidad en la replicación, pero con suficiente flexibilidad (oportunidad de errores) como para generar innovaciones sobre las que pueda actuar la presión selectiva, lo cual permite evolución.

Puntos calientes de mutación (“hot-spots”): son puntos o zonas dentro del genomio donde se concentran mutaciones con una frecuencia mayor que la esperada si se distribuyeran al azar.

Ejemplo: en el gen lacI hay una zona especialmente “caliente” cerca de la base 200, donde la probabilidad de encontrar mutaciones es muy superior a la del resto de la secuencia de ADN de ese gen.

Explicación: algunas bases, dentro de un determinado contexto de secuencia, son modificadas químicamente por acción de alguna enzima (normalmente una metilasa), y ello provoca una mayor susceptibilidad a la aparición de mutaciones puntuales:

La citosina (C), dentro del contexto de secuencia siguiente:

C C A G G

G G T C C

es metilada por una metilasa específica (que reconoce precisamente a esas dos citosinas dentro de esa secuencia), para dar 5-metilcitosina. La 5-metil citosina experimenta espontáneamente una desaminación oxidativa, que la convierte en timina, de manera que se produce finalmente una transición: C:G à 5-metil-C:G à T:G (emparejamiento anómalo)à T:A

2.1.2        CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

Si la mutación afecta a una región en 5' que actúa en cis:

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Determinadas mutaciones puntuales en el promotor impiden que la ARN polimerasa se una a esta secuencia; entonces el promotor queda inactivado y no se produce la expresión de los genes del operón.

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En otros casos los efectos son diferentes. Por ejemplo: se recordará que el promotor del operón lac tiene una secuencia -10 atípica, que obliga a que la expresión a alto nivel requiera el concurso de la proteína CAP activa. Pues bien, por medio de mutaciones puntuales se puede lograr que esa secuencia atípica adquiera las características de las secuencias -10 típicas (a base de TATA, o similar). En este caso, el efecto de estas mutaciones es que el operón lac se vuelve independiente de la proteína CAP para su expresión eficiente: el operón se hará independiente de la represión catabólica.

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En los operones sometidos a control negativo, determinadas mutaciones en el operador provocan una menor afinidad de la proteína reguladora (del represor). El efecto es el de crear una expresión constitutiva (es decir, el operón se expresa incluso en presencia del represor activo, debido a que éste no reconoce al operador mutante).

Si la mutación afecta a una zona codificadora: se produce la alteración de un codón. Las consecuencias de la alteración pueden ser muy variadas:

1)      Si la nueva tripleta (codón) codifica el mismo aa. que la antigua (debido a la sinonimia o “degeneración” del código genético, que afecta sobre todo a la tercera base del codón) se origina una mutación neutra, que es “silenciosa” (no hay ningún cambio en el fenotipo).

2)      Si la nueva tripleta codifica un aa. diferente del original, tenemos varias posibilidades:

a)      mutaciones de sentido erróneo o alterado (“missense”):

i)        si el nuevo aa. es de un tipo químico similar al antiguo, puede cumplir una función semejante en la proteína mutante, por lo que el fenotipo sería también una mutación silenciosa por sustitución de aa.

ii)       En otros casos el nuevo aa. provoca una inestabilidad estructural, que puede reflejarse en que la proteína sea termosensible o criosensible, o más susceptible a efectores alostéricos. La proteína termosensible es funcional a temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas relativamente altas, a las cuales la correspondiente proteína silvestre es activa. La proteína criosensible es funcional a temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas relativamente bajas, a las cuales la proteína silvestre es activa. La proteína más susceptible a efectores alostéricos es aquella que se inhibe por efectores de forma más acusada. En esta categoría entran también las proteínas con actividad residual.

iii)     Por otro lado, podemos encontrar proteínas que pierden su actividad biológica debido a que la sustitución del aa. provoca la alteración de la estructura secundaria y terciaria de la proteína: por ejemplo, la aparición por mutación de una prolina en mitad de una a-hélice destruye esta estructura, y puede originar inactivación de la función.

iv)     La alteración del centro activo suele provocar inactivación total o parcial. NOTA: Aquí se plantea la siguiente pregunta: si la mutación inactiva totalmente la capacidad funcional de la proteína, ¿cómo podemos reconocer que esa proteína alterada está presente en la célula? La proteína se puede identificar por medio de anticuerpos (Ac) obtenidos frente a la proteína silvestre. Si ponemos en contacto estos Ac con un extracto de las células mutantes, se producirá una reacción antígeno-anticuerpo. Las proteínas inactivas caracterizadas de esta manera se suelen denominar como “CRM” iniciales de “cross-reactive material” (material que da reacción cruzada respecto de la proteína silvestre).

b)      mutaciones “sin sentido” (“nonsense”), o sea, aquellas que cambian un codón original a una de las tres tripletas que significan “señal de parada” de la traducción:UAG (codón “ámbar”), UAA (codón “ocre”), UGA (codón “ópalo”). Obviamente, el efecto de estas mutaciones sin sentido es producir la detención de la lectura del ARNm por parte de los ribosomas. Por lo tanto se produce una proteína truncada, que suele ser inactiva.

           Si la mutación sin sentido se produce en un gen de un operón policistrónico, y si esa mutación cae cerca de una zona del ARNm capaz de formar estructuras secundarias en horquilla, aparte del efecto de mutación sobre el gen afectado, se detectará un fenómeno de polaridad, debido a que el acoplamiento transcripción-traducción provoca la no transcripción de la región situada más allá (en sentido 3') de la zona de la horquilla. O sea, no habrá transcripción de los genes distales del operón.

2.2      MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA [“FRAMESHIFTS”]

            Se pueden originar por pérdida o ganancia de un pequeño nº de nucleótidos (que no sea 3 o múltiplo de 3)

Base molecular: Suelen ocurrir en zonas del ADN con secuencias repetitivas. En este tipo de secuencias, durante la replicación o la recombinación, se pueden producir malos alineamientos por desplazamiento de una o varias copias de la secuencia repetitiva.

Ejemplo:

G T C C G T C C G T C C G T C C

C A G G C A G G C A G G C A C C

Se produce un cambio total en el sentido del mensaje genético, a partir del sitio de la mutación se sintetiza una proteína inactiva, a menudo truncada (debido a que al cambiar la pauta de lectura, pueden aparecer tripletas sin sentido).

Si la pérdida es de 3 nucleótidos (o múltiplo de 3), y la pequeña delección no afecta a una zona importante de la proteína, se puede producir un producto que aún tenga actividad biológica.

2.3        GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS)

Suponen la eliminación de cientos e incluso miles de nucleótidos.

Base molecular: Formación de grandes bucles intracatenarios, con posterior escisión de dichos bucles. Normalmente en los extremos del material que se va a delecionar existen secuencias de ADN que son repeticiones directas una de otra, lo que facilita algún fenómeno de recombinación que lleva a la eliminación del material (bucle) intercalado entre esas secuencias.

Consecuencias: Mutación irreversible e inactivadora total de uno o varios genes.

2.4        INVERSIONES

Cambio de orientación de un segmento de ADN. En muchos casos se deben a emparejamiento y ulterir recombinación entre secuencias inversamente repetidas en los extremos del material que sufre la inversión.

Consecuencias: En muchos casos no hay consecuencias fenotípicas, ya que simplemente se ha invertido el orden de los genes del segmento invertido en relación al resto del genoma.[1] A diferencia de las deleciones, las inversiones suelen revertir, precisamente por un nuevo proceso de recombinación entre las secuencias inversamente repetidas.

2.5        TRANSLOCACIONES

Traslado de un segmento a otro lugar del genomio.

2.6        DUPLICACIONES EN TÁNDEM

            Se trata de la aparición de una copia de una zona de ADN a continuación de la localización del original. Suelen deberse al emparejamiento y recombinación entre secuencias similares en dos moléculas de ADN (en realidad, en este evento, de las dos moléculas de ADN, una se queda con una duplicación mientras que la otra se queda con una delección).

            Si el segmento duplicado es grande y lleva varios genes, no suele conducir a inactivación génica (ya que aunque en la juntura de la duplicación puede haber una mezcla de dos genes truncados, sigue habiendo copias silvestres de dichos genes en el mutante).

            Una de las propiedades más características de las duplicaciones en tándem es su inestabilidad, ya que revierten con gran frecuencia por nueva recombinación dentro del segmento duplicado.

            A pesar de esto, las duplicaciones parecen haber jugado un papel importante en la evolución. Tras una duplicación que se haya estabilizado, hay dos copias de uno o varios genes, de modo que una de las copias de cada pareja puede lentamente ir evolucionando e incluso adquirir una nueva función.

2.7        MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES

            La inserción de una secuencia de inserción (IS) o de un transposón (Tn) en de un gen origina la inactivación insercional, debida a:

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desplazamientos de la pauta de lectura, que como antes indicamos, generan frecuentes señales de fin de traducción;

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terminación de transcripción dependiente de Rho, con efectos polares (debido a que las IS llevan frecuentes señales de terminación compleja de la transcripción, dependiente de r).

           Una vez que ha ocurrido una inserción de una IS o de un Tn, pueden producirse ulteriores delecciones secundarias de todo o de parte del elemento transponible, y a veces también delecciones del material genético adyacente (fenómenos de escisión imprecisa del IS o Tn).

            Por otro lado, dadas dos secuencias IS del mismo tipo, situadas a cierta distancia una de la otra, por fenómenos de recombinación propiciados por dichas IS se pueden producir:

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inversiones del material intercalado entre ambias copias del IS;

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translocaciones del material intercalado entre esas secuencias de inserción.

2.8        REPASO DE CONCEPTOS ÚTILES EN EL TRABAJO CON MUTANTES BACTERIANOS

            Repasemos algunos conceptos y términos que son igualmente de uso común en muchos estudios de genética:

            Dependiendo de que la mutación genética se manifieste o no a nivel fenotípico, y según el grado de afectación fenotípica, podemos clasificar las mutaciones de la siguiente manera:

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mutaciones silenciosas (o neutras), si no hay efecto fenotípico;

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mutaciones que implican alteración del fenotipo silvestre:
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letales: si ocasionan la muerte o pérdida de viabilidad del microorganismo;

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condicionalmente letales: si bajo determinadas condiciones el mutante pierde la viabilidad, pero bajo otras la mantiene.

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mutaciones de alteración fenotípica que suponen la pérdida o la merma de alguna función que no sea esencial para la viabilidad del organismo. Dentro de ellos están los mutantes condicionales (su fenotipo alterado se manifiesta en determinadas circunstancias).

            Las mutaciones condicionales (incluidas las condicionalmente letales) son muy útiles para estudiar aquellos genes esenciales para la bacteria. En estos mutantes hay que distinguir dos tipos de condiciones:

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condiciones restrictivas (también llamadas no-permisivas): son aquellas condiciones ambientales bajo las cuales el mutante pierde la viabilidad, o su fenotipo se ve alterado, debido a que el producto afectado por la mutación pierde su actividad biológica.

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condiciones permisivas: son aquellas bajo las cuales el producto del gen mutado es aún funcional.

Algunos ejemplos de mutantes condicionales muy empleados en genética:

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mutantes sensibles al calor (termosensibles). Se suelen denominar con las siglas ts. El producto del gen mutado es más sensible al calor que el producto silvestre

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mutantes de biosíntesis sensible al calor;

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mutantes sensibles al frío (criosensibles)

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mutantes sensibles a efectores alostéricos

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mutantes suprimibles por supresores extragénicos (por ejemplo, por ARNt supresores, mutantes);

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mutantes dependientes de estreptomicina;

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mutantes estabilizados osmóticamente (sólo son estables en altas concentraciones de sales).

            En principio, y “por definición”, es imposible obtener mutantes letales estrictos de genes esenciales para la viabilidad de la bacteria (p. ej., en genes de la ADN-polimerasa, ARN-polimerasa, ADN-ligasa, etc.), pero sí es posible conseguir mutantes condicionalmente letales, especialmente los termosensibles. Por ejemplo, si tras un tratamiento mutagénico sembramos células de Escherichia coli en placas y las cultivamos a 30ºC, y luego hacemos réplicas en placas que se incuban a 42ºC, las colonias “ausentes” en estas últimas nos señalan correspondientes colonias de la placa matriz candidatas a mutantes termosensibles.

            Otro tipo de mutantes condicionales muy empleados en bacterias son aquellos con mutaciones sin sentido. Como se recordará, cuando el ribosoma llega al codón sin sentido, se detiene la traducción ulterior. Sin embargo, si esa bacteria tiene simultáneamente una segunda mutación de tipo supresor extragénico, a saber, un ARNt mutante adecuado, se puede restablecer el fenotipo silvestre (al menos parcialmente).

3        CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

            Para caracterizar genéticamente una mutación (es decir, para conocer qué tipo de mutación es) se recurre normalmente a pruebas de reversión de cada mutante.

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Las mutaciones puntuales pueden revertir o ser suprimidas por una 2ª mutación (ver más adelante, en este mismo capítulo).

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Igual ocurre con algunas mutaciones de desfase de la pauta de lectura.[2]

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Las inserciones sólo pueden revertir por una delección exacta del material insertado.

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Las delecciones no pueden revertir.

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Por otro lado, las mutaciones generadas por elementos genéticos transponibles no aumentan su frecuencia por tratamiento con agentes mutagénicos, mientras que el resto sí lo hacen.

4          TASA DE MUTACIÓN

            En una población bacteriana se define la tasa de mutación (T) para un determinado fenotipo como la probabilidad de que una célula mute a ese fenotipo en un determinado intervalo de tiempo. Luria y Delbrück (1943) escogieron como intervalo de tiempo unitario el correspondiente a un ciclo celular (o sea, a una generación), que es el tiempo necesario para completar una ronda de división celular. Por lo tanto:

T = m / d, donde m es el nº de mutaciones surgidas en un tiempo t, y d es el nº de divisiones ocurridas en ese tiempo t.

 Si expresamos d en función del número de células: T= m / (N-N0)

NOTA 1: La tasa T de mutación espontánea es constante para cada división celular a distintas tasas de crecimiento

En la expresión anterior hay que introducir un factor de corrección, ya que en el momento de determinar el número de células (N), las bacterias se encuentran en distintas etapas del siguiente ciclo celular, de modo que el promedio real de divisiones es mayor que N en un factor equivalente a 1/ln 2. Resulta, entonces:

T= m·ln2 /(N-N0) = 0,69·m / (N-N0)

A pesar de lo sencillo de esta fórmula, el cálculo en la práctica de la tasa de mutación no es tan fácil como ésta parece dar a entender. Ello se debe a que el parámetro m mide el número de eventos de mutación en un lapso de tiempo, que no equivale al número de bacterias mutantes medidas. Por lo tanto, y a pesar de lo fácil que suele ser cuantificar el número de mutantes, en el experimento, en ese cantidad medida se incluyen los descendientes de eventos más o menos antiguos de mutación a lo largo de ese experimento. Para calcular m hay que recurrir a ciertos métodos estadísticos.

Por ejemplo, se puede combinar un experimento de tipo de Luria y Delbrück con la distribución de Poisson. Imaginemos que sembramos 20 tubos independientes con la misma cantidad inicial de bacterias sensibles a la estreptomicina e incubamos el mismo tiempo en las mismas condiciones, de modo que la N-N0 sea 5.6X108; imaginemos que en esa prueba de las fluctuaciones en 11 de los 20 tubos no han surgido mutantes resistentes al antibiótico. De acuerdo con la aproximación de Poisson a la distribución normal, la probabilidad de tener cero (0) mutaciones en un cultivo sería:

P0 = m0·e-m/0!

Aplicando esto a nuestro ejemplo:

P0 = 11/20 = 1·e-m/1

Y por lo tanto, podemos despejar y resolver el valor de m = -ln11/20 = 0.59. Ahora podemos calcular la tasa de mutación:

T = 0.6·0.59/5.6X108 = 7.3·10-9

NOTA 2: Obsérvese que hemos definido la tasa de mutación respecto de un fenotipo. Esto significa que aquellos fenotipos que dependan de varios genes tendrán tasas de mutación superiores a las de aquellos que dependan de un solo gen. Por ejemplo, la tasa de mutación hacia auxotrofía para la histidina o el triptófano (cuya biosíntesis depende de varios genes) está en torno a 10-7, mientras que la tasa de mutación a resistencia a estreptomicina (que, como se recordará, depende de la alteración del gen de la proteína ribosómica S12) es de sólo 10-10 o 10-11.

5          REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

            Las variaciones fenotípicas producidas por las mutaciones no-silenciosas son transmisibles a la descendencia. Es decir, una vez producido el cambio, éste es permanente, pero no necesariamente irreversible (como ya dijimos, solamente las grandes delecciones son irreversibles).

            La reversibilidad de las mutaciones suele deberse a una segunda mutación que restaura el fenotipo original. Esta 2ª mutación puede ser de dos tipos principales, y varios subtipos:

1)      Reversión (en sentido estricto), que restaura el genotipo original. Esto equivale a una retromutación (“back-mutation”).

2)      Supresión: la 2ª mutación suprime los efectos de la 1ª pero no restaura el genotipo original. Por lo tanto, tras la mutación supresora, la célula queda con dos mutaciones. La supresión se clasifica a su vez en:

a)      Supresión indirecta: no se corrige el producto del primer gen, pero la 2ª mutación anula las consecuencias fenotípicas. Ejemplos:

i)        Se abre una nueva vía para la síntesis del producto afectado por la 1ª mutación.

ii)       El producto mutado de la 2ª mutación puede sustituir al producto de la primera.

iii)     Se provoca un cambio en el medio intracelular, que hace que el producto alterado de la primera mutación vuelva a ser funcional.

b)      Supresión directa: la 2ª mutación corrige el producto del primer gen mutado. Puede ser de dos tipos principales:

i)        Supresión intragénica: la 2ª mutación ocurre en el mismo gen donde ocurrió la primera.

ii)       Supresión intergénica (= extragénica): la mutación supresora afecta a otro gen, que suele ser uno de los genes implicados en la maquinaria de traducción del ARNm: ARNt y proteínas ribosómicas.

5.1        BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS

1.      Introducción de un desfase de signo opuesto al de la primera mutación à restauración de la pauta de lectura alterada por una previa mutación de desfase de lectura (“frameshift”). La única zona alterada tras la mutación supresora sería la que queda entre ella y la 1ª mutación. Si esta zona es corta y no es esencial para la actividad biológica, se puede restablecer el fenotipo primitivo.

2.      Supresiones en el mismo codón que quedó afectado por la 1ª mutación, de modo que se codifica un aminoácido distinto del silvestre y distinto del aa. del primer mutante, pero que restaura la funcionalidad de la proteína. A este tipo de supresión se la denomina también pseudorreversión.

3.      Mutación puntual compensatoria en un sitio distante respecto de la primera mutación: la 2ª mutación compensa a la 1ª, de modo que se restaura la estructura tridimensional y/o el centro activo de la proteína.

5.2        BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS

1)      Por ARNt mutantes (= ARNt supresores)

a)      supresores de mutaciones que introducen codones de parada de lectura (o sea, de codones “sin sentido, nonsense”): son ARNt mutados en el anticodón, de modo que este anticodón mutado puede emparejarse con alguno de los tres tipos de codones “sin sentido”, insertando ahora los aa. correspondientes que transportan; por lo tanto, impiden la terminación prematura de la traducción. Ejemplos: El codón sin sentido UAG (“ámbar”) puede ser suprimido por versiones mutantes (supresoras) de los siguientes ARNt:

Tipo de ARNt supresor

Normalmente reconoce

ARNtSer

UCG

ARNtGln  

CAG

ARNtTyr  

UC

ARNtLys

AAG

(La letra sombreada indica la base que cambia en la mutación supresora).

b)      El codón sin sentido UAA (“ocre”) puede ser suprimido por una versión mutante de ARNtGly à GAA

c)      Existen supresores más raros que suprimen mutaciones de sentido erróneo (“missense”): Ejemplo: El ARNtGly cuyo anticodón es UCC, por mutación se convierte en un ARNt supresor cuyo anticodón es UCU, que entonces reconoce al codón AGA (de la Arg). Por lo tanto, este supresor inserta Gly frente a cada codón AGA.

d)      supresores de desfases de lectura de +1 nucleótido: son ARNt mutantes que tienen un anticodón con 4 nucleótidos, en lugar de los 3 habituales.Ejemplo: Existe un ARNtPhe que tiene un anticodón que reconoce la secuencia UUUC.

2)      Por proteínas ribosómicas mutantes: Los ribosomas derivados de la alteración por mutación de determinadas proteínas adquieren zonas de conformación cambiada, de modo que reconocen tripletas de forma errónea. Al introducir aminoácidos cambiados en codones que a su vez proceden de mutaciones, pueden restaurar la funcionalidad de algunas proteínas mutantes.Ejemplos:

a)      mutaciones ram, que afectan a las proteínas S4 y S5 de la subunidad 30S del ribosoma, de modo que éste puede suprimir una gran variedad de mutaciones sin sentido y por desfases. (El nombre de ram corresponde a las iniciales de ribosomas ambiguos).

b)      Mutaciones StrR: tienen afectada la proteína S12 del ribosoma. Hacen que las mutaciones sin sentido sean menos defectuosas (“leaky” = débiles).

5.3        EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES

            Cada supresor tiene una eficacia característica de supresión, que se refleja en la proporción de cadenas polipeptídicas mutantes que son terminadas de forma normal (en lugar de quedarse truncadas). Esta eficacia depende, esencialmente de:

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la concentración del ARNt supresor en la célula;

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afinidad del ARNt supresor hacia la aminoacil-ARNt-sintetasa;

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afinidad del aa-ARNt por el ribosoma, en competencia con los factores de terminación de traducción que reconocen el mismo codón “sin sentido” (de parada de lectura).

           La mutación supresora, por sí misma disminuye la velocidad de crecimiento de la bacteria, debido a que, aparte de su capacidad supresora, introduce errores de lectura en los ARNm normales.

            Los supresores han de ser, por fuerza, poco eficientes, como para no hacer que la célula muera por introducción de demasiados errores en la lectura de los ARNm normales (es decir, la mayor parte de las veces, los supresores introducen el aminoácido correcto). Pero por otro lado, han de ser suficientemente eficicientes como para poder introducir aminoácidos en codones mutantes con la frecuencia adecuada para suprimir la mutación primaria. Normalmente, los supresores típicos suprimen 5-10% de las veces. Es decir, la mayoría de las veces se introduce el aa. correcto frente al codón correcto.

6          AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES

            Anteriormente comentamos que el medio ambiente no induce mutaciones concretas (p. ej., el antibiótico no provoca la aparición de los mutantes resistentes). Ahora bien, lo que sí pueden hacer determinadas condiciones ambientales es elevar la tasa global de aparición de mutaciones.

            Determinados agentes ambientales físicos o químicos pueden dañar el ADN o interferir con la maquinaria replicativa, de modo que provocan una mayor frecuencia de aparición de mutaciones (y en este sentido hablamos de “mutaciones inducidas”). A dichos agentes se les llama mutágenos o agentes mutagénicos. Así pues, en última instancia, los mutágenos causan alguna alteración en el ADN que

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bien no puede ser reparada convenientemente,

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o bien es un daño tan extenso que sobrepasa la capacidad de los mecanismos celulares normales de reparación (consultar en el tema 13 el apartado sobre “Mecanismos de Reparación de los daños al ADN”).

6.1        AGENTES FÍSICOS

6.1.1        RADIACIÓN UV

            Es el mutágeno físico más empleado en el laboratorio para obtener mutaciones en las bacterias. Como ya estudiamos en su momento, su efecto principal es originar dímeros de pirimidina intracatenarios (con creación de una anillo ciclobutano entre dos Py consecutivas). Las proporciones de lesiones son las siguientes:

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50% T-T

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40% T-C

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10% C-C

           Las mutaciones aparecen principalmente como consecuencia del mecanismo posreplicativo de reparación propenso a error (o sea, el sistema SOS). Con menor frecuencia la luz UV ocasiona hidratación de la C, lo que da origen a transiciones.

6.1.2        RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

            Tienen mayor poder de penetración que los rayos UV, pero son de difícil manejo, por lo que se emplean poco en bacterias. Los rayos X ocasionan daños reparables por el sistema SOS.

             Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos g) provocan labilizaciones en el ADN, que terminan en roturas en las hebras del ADN (por ataque al enlace fosfodiéster), que finalmente pueden conducir a delecciones.

6.2        AGENTES QUÍMICOS

Se pueden agrupar en varias categorías:

1)      Análogos de bases, que se incorporan durante la replicación del ADN.

2)      Agentes hidroxilantes o desaminantes de las bases nitrogenadas.

3)      Agentes alquilantes.

4)      Agentes intercalantes, que se introducen en la doble hélice del ADN, entre pares de bases consecutivas.

5)      Bloqueadores del emparejamiento de las bases.

6.2.1        ANÁLOGOS DE BASES

            Son sustancias con una estructura en anillo similar a las bases naturales de los ácidos nucleicos, pero con propiedades químicas diferentes. Como ejemplos tenemos:

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5-bromouracilo (5-BrU)

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2-aminopurina (2AP).

            Estas moléculas entran a las células y son convertidas a los correspondientes “dNTP”, de modo que su estructura les permite ser incorporados durante la replicación del ADN.

1) El 5-BrU es análogo de la T. Propicia transiciones T:A àG:C debido a que experimenta frecuentes cambios tautoméricos desde su forma ceto a su forma enol:

BUceto:AàBUenol:G

Si partimos de una pareja A=T y en la 1ª ronda de replicación la ADN-polimerasa introducen un BUceto frente a la adenina, los acontecimientos hasta llegar a la mutación se pueden resumir así:

A:T à (la primera replicación incorpora BU) àA:BUceto à(tautomerización y 2ª replicación)  à G:BUenol à (3ª replicación) à G:C

2) La 2-AP es un análogo de la A. Provoca transiciones A:Tà C:G debido a sus frecuentes tautomerizaciones (APamino à APimino). Veamos el proceso:

A:T à (primera replicación) à APamino:T à (tautemerización y 2ª replicación) à APimino:C à (3ª replicación) à G:C

6.2.2        AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES

Alteran las Pu o las Py, de modo que:

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causan errores en el emparejamiento, o bien

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labilizan las bases, de modo que éstas espontáneamente se modifican químicamente con gran frecuencia.

1) Ácido nitroso: provoca una desaminación oxidativa de A y C, lo que origina transiciones

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sobre C à dU, que se empareja con la A.

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sobre A (6-aminopurina) à hipoxantina (HX) (6-oxopurina), que en su forma ceto se empareja con la citosina: A:T à HXceto:C à G:C

El nitroso también desamina oxidativamente a la G, pero en este caso no hay mutación: G à xantina, que al igual que la G, se empareja con la C.

 

2) Hidroxilamina (NH2OH): actúa específicamente sobre la citosina, añadiéndole un hidroxilo a su grupo -NH2.

6.2.3        AGENTES ALQUILANTES

            Introducen radicales alquílicos en una cadena (los alquilantes monofuncionales) o en las dos cadenas (los bifuncionales) del ADN, produciendo efectos letales y mutagénicos.

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Los efectos letales fueron estudiados en el capítulo 19 (“Acción de los agentes químicos”).

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Los efectos mutagénicos dependen sobre todo de la reacción con el O6 de la G.

Algunos agentes alquilantes empleados en laboratorio:

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gas mostaza: mostazas nitrogenadas y sulfuradas, como por ejemplo:

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Cl-CH2-CH2-S-CH2-CH2-Cl : di-(2-cloroetil)-sulfuro.

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etil-etano-sulfonato (EES): CH3-CH2-SO2-O-CH2-CH3

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etil-metano-sulfonato (EMS): CH3-SO2-O-CH2-CH3

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nitrosoguanidina (NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina.

          Todos estos agentes, excepto la NTG, actúan tanto in vivo como in vitro. La NTG sólo actúa in vivo, ya que su efecto lo ejerce sobre la horquilla de replicación del ADN. La NTG es uno de los mutágenos más potentes que se conocen, pero es un agente “sucio”, en el sentido de que genera varias mutaciones en la misma célula. Induce reparación SOS propensa a error, dando origen a transiciones, transversiones y desfases del marco original del lectura.

           Como hemos dicho, estos agentes originan un daño premutagénico principal consistente en alquilación del O6 de la G. Ello provoca una gran distorsión en la doble hélice, que posteriormente se plasma en transiciones del tipo G:C à A:T.

            Sin embargo, muchas bacterias poseen un sistema específico para reparar las lesiones de  la O6-alquil-guanina, que funciona de la siguiente manera:

1)      La bacteria posee una O6-alquil-glucosilasa, que rompe el enlace N-glucosídico entre la O6-alquil-guanina y la desoxirribosa. Esto provoca la creación de un sitio apurínico (sitio AP).

2)      El sitio AP es reconocido por una endonucleasa correctora (apurinasa), que rompe el enlace fosfodiéster del lado 5' del sitio apurínico.

3)      Se produce una reparación por escisión-resíntesis de un pequeño nº de nucleótidos, pero si el daño es muy grande se produce una situación SOS que tiende a ser reparada por el sistema propenso a error ya estudiado, lo que provoca introducción de errores, que conducen a transiciones y transversiones.

6.2.4        SUSTANCIAS INTERCALANTES

            Se introducen entre los pares de bases del ADN, dando origen a pérdida o ganancia de nucleótidos (o sea, generan mutaciones de cambio de la pauta de lectura del mensaje genético). Estas sustancias son moléculas planares con 3 o 4 anillos conjugados, que presentan un cierto parecido con los pares de bases del ADN, pero no se pueden incorporar covalentemente al esqueleto de éste, sino que se intercalan entre dos pares de bases consecutivas, con lo que provocan distorsiones de la doble hélice.

Algunos ejemplos:

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derivados de la acridina, como el naranja de acridina

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bromuro de etidio (ver nota[3])

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derivados de la flavina (como la proflavina).

            Estabilizan emparejamientos erróneos durante la replicación y la recombinación del ADN, dando origen a desplazamientos de la pauta de lectura.

Aplicaciones: Algunos se están ensayando en cuanto a su capacidad de inhibir tumores cancerígenos, o como antivirásicos, o contra el protozoo causante de la malaria.

6.2.5        AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE BASES

Este grupo incluye potentes carcinógenos como:

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benzo-a-pireno

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aflatoxina-B1

            Modifican purinas, provocando grandes lesiones en el ADN, que inducen el sistema SOS de reparación, lo que finalmente implica reparación propensa a error. Las aflatoxinas son unas micotoxinas (producidas por hongos, como Aspergillus).

7          LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE CARCINOGÉNICAS

            Uno de los más claros indicios de que el cáncer surge a menudo como consecuencia de fenómenos mutagénicos es que la mayoría de los carcinógenos son también mutágenos.

            Ames y sus colaboradores desarrollaron, a finales de los años 70, una prueba rápida, sencilla y económica por la que se pueden ensayar compuestos como posibles carcinógenos. Su base consiste precisamente en ver si son mutágenos frente a bacterias (es decir, se comprueba si tras el tratamiento de un cultivo bacteriano con la sustancia en cuestión, aumenta la tasa de aparición de mutantes.

TEST DE AMES

            Usa una serie de cepas his- de Salmonella typhimurium, muy bien caracterizadas a nivel genético-molecular.

1)      Una suspensión de la bacteria se siembra masivamente (unas 108) en placas Petri que llevan un medio mímino (MM) -por lo tanto, sin aminoácidos- .

2)      A continuación, en el centro de la placa se coloca un pequeño disco de papel de filtro impregnado con la sustancia que se desea ensayar. Acto seguido, las placas se incuban en estufa a la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria (37oC).

3)      Las placas se sacan de la estufa (a las 24 h., por ejemplo) y se cuentan las colonias surgidas en cada placa, comparándolas con las colonias de una placa control que no llevaba la sustancia. Las colonias habrán surgido por el crecimiento de bacterias que hayan experimentado reversiones (=retromutaciones). Cada reversión en el alelo original his-- restituye el fenotipo silvestre His+, y por lo tanto capacita a la bacteria a crecer y dividirse en el medio mínimo.

            Si la prueba da resultado positivo (o sea, la sustancia induce altas tasas de mutación sobre la bacteria), es muy probable que el compuesto ensayado sea también carcinógeno, por lo que habrá que continuar estudiándolo a estos niveles. (El 90% de los compuestos que dan positivo en el Test de Ames se ha demostrado que son carcinógenos).

Ulteriores mejoras en el test de Ames

            En los últimos años esta prueba ha sido modificada para mejorarla o adaptarla a situaciones especiales. Veamos algunas de estas modificaciones:

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uso de cepas de Salmonella defectivas en reparación (uvrA--, uvrB--, uvrC--, etc). En estas cepas, cualquier daño al ADN no puede ser corregido con total eficiencia. Esto hace que estas cepas sean más sensibles frente a sustancias con menor potencial carcinogénico.

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Muchos agentes son mutágenos en humanos sólo tras su “activación” metabólica por el hígado, pero son inactivas por sí mismas. Para detectar a estas sustancias, el test de Ames puede modificarse incorporando un extracto microsomal estéril (fracción libre de células de hígado animal o de cultivos de tejidos). El extracto microsomal posee oxigenasas que originan epóxidos a partir de la sustancia a ensayar, y a su vez son estos derivados de tipo epóxido los que verifican la acción mutagénica.

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Algunas sustancias a ensayar no entran eficientemente a la bacteria debido al efecto de barrera de la membrana externa de la pared celular. Para solventar esto, se recurre a emplear mutantes LPS-- de Salmonella (o sea, mutantes alterados en el lipopolisacárido, LPS), que facilitan la entrada de moléculas hidrofóbicas.

 

8        ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1        TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO

8.1.1        MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS COLONIAS:

            Los rasgos culturales de las bacterias son muy fáciles de ver en los cultivos en placas de Petri, por lo que igualmente es fácil detectar cambios en los aspectos de las colonias que pudieran deberse a mutaciones. Antes de nada, vamos a describir brevemente tres tipos de colonias que pueden darse en una misma especie:

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colonias S (lisas): son circulares, de borde liso o continuo; convexas obtusas (plano-convexas); superficie lisa y brillante; se dispersan fácilmente en agua, dando suspensiones homogéneas.

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colonias M (mucosas): son parecidas a las S, pero son convexas más agudas; textura mucosa (al cogerlas con asa de siembra, se arrastra un “moco”).

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colonias R (rugosas): a menudo presentan un borde ondulado o festoneado; son planas; textura rugosa, y aspecto mate (no brillante); no se dispersan bien en agua, dando grumos más o menos gruesos.

            Pues bien, en muchas especies bacterianas se pueden estudiar fenómenos de disociación de tipos de colonias en cultivos, debido a mutaciones que alteran moléculas de las envueltas (p. ej., de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, de la cápsula, etc.). Veamos algunos ejemplos:

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En algunas bacterias se puede observar una disociación M à S, que se suele deber a la pérdida de la capacidad de sintetizar cápsula.

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En algunas bacterias Gram-positivas la disociación S à R se debe a pérdida de la cápsula.

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En bacterias Gram-negativas, las disociación S à R se debe a menudo a la pérdida de la capacidad de sintetizar las cadenas laterales polisacarídicas del LPS (antígeno somático “O”).

 

           Muchas de estas disociaciones tienen bastante interés clínico, ya que en bacterias patógenas, el fenotipo mutado (sobre todo el rugoso) implica la pérdida de propiedades de virulencia y de especificidad antigénica.

8.1.2        MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

            En estudios de genética bacteriana (p. ej., a la hora de elaborar mapas genéticos), es muy habitual recurrir al empleo de mutantes auxotróficos (es decir, mutantes afectados en algún gen de alguna ruta biosintética -de aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas-). Por supuesto, estos mutantes presentan interés por sí mismos, ya que su estudio permite “diseccionar” la base genética de las vías metabólicas.

            Veamos a continuación un par de maneras de aislar y seleccionar mutantantes bacterianos auxotrofos:

1) Aislamiento de auxotrofos (sin enriquecimiento):

cultivo original à tratar con mutágeno à lavarà siembra placas de medio mínimo (MM)+ suplementos nutricionales à réplica a MM

            Se comparan las colonias de la placa-matriz (medio con suplementos nutricionales) con las colonias que hayan aparecido en la placa de réplica (carente de suplementos). La ausencia de colonia en la placa de réplica en una posición en la que existe colonia en la placa-matriz incica que la colonia de la placa matriz que no tiene “gemela” en la réplica es un mutante auxotrófico.

            Una vez que sabemos que una colonia es un mutante auxotrófico, hay que determinar qué requerimiento nutricional le hace falta (es decir, qué compuesto o compuestos no puede sintetizar debido a la mutación). Para ello se realiza una sencilla prueba en placas de Petri, denominada auxonograma.

           Sin embargo, aun cuando tratemos a un cultivo con un agente mutagénico, la frecuencia de aparición de un determinado fenotipo mutante es relativamente baja. Esto significa que en el experimento anterior, tendríamos que sembrar y replicar numerosas placas con grandes números de colonias, con objeto de alcanzar el umbral de probabilidad para detectar mutaciones auxotróficas. Para solventar este inconveniente, se suele recurrir a una modificación del método anterior basada en enriquecer en mutantes auxotrofos el cultivo tratado con el mutágeno:

2) Enriquecimiento por penicilina para el aislamiento de mutantes auxotróficos (resumen de un protocolo):

cultivo original (bacteria silvestre, prototrofa)

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tratamiento con el mutágeno

ß

mezcla de bacterias muertas (p. ej., el 90% del cultivo inicial) + bacterias vivas, entre ellas unos pocos mutantes de diversos tipos

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el cultivo se transfiere a un medio líquido rico, para permitir la recuperación y la expresión fenotípica (lag fenotípico)

ß

incubar unas cuantas horas

ß

el cultivo se lava y se pasa a un medio líquido mínimo

ß

añadir penicilina e incubar

ß

la penicilina mata a los prototrofos, pero los auxotrofos no mueren, porque no crecen en MM (muerte selectiva de los parentales prototrofos)

ß

plaquear en medio sólido rico

ß

hacer réplica a medio sólido mímino

ß

identificar los auxotrofos (no crecen en MM)

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recuperar los auxotrofos de las placas de medio rico, y caracterizarlos (hacer auxonograma)

8.1.3        MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

            Los mutantes resistentes a antibióticos surgen por varios tipos de mecanismos, entre los que se encuentran:

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alteración de algún gen que codifica una diana (sitio de unión) del antibiótico;

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alteración de algún gen responsable de permeabilidad al antibiótico.

Los mutantes resistentes a fagos surgen esencialmente por alteración de receptores de la superficie celular, sobre los que se adsorben los fagos.

            Ambos tipos de mutantes son de muy amplio uso para “marcar” cepas bacterianas en experimentos de genética (especialmente los que implican algún proceso de transferencia de material genético desde una estirpe donadora a otra receptora). Estos marcadores genéticos permiten seleccionar directamente la cepa que los porte añadiendo al medio de cultivo el correspondiente agente selectivo (antibiótico o fago), que obviamente mata o inhibe el crecimiento de las cepas sensibles.

8.1.4        MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS FUENTES DE C Y ENERGÍA

            Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados sustratos, pero pueden recurrir a otros alternativos. Para aislar estos mutantes se puede recurrir en muchos casos al uso de medios diferenciales que incorporan indicadores de pH, que cambian de color en función del uso o no del sustrato en cuestión.

Por ejemplo: si quisiéramos aislar mutantes Lac-- de E. coli, sembraríamos en Agar Mac Conckey. Los mutantes Lac-- dan colonias transparentes, mientras que el fenotipo silvestre Lac+ da colonias rojas opacas con un precipitado alrededor de sales biliares (recordar el uso de este medio en las prácticas).

9          VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS

            Como ya sabemos, los plásmidos son material genético extracromosómico que se replican independientemente del cromosoma (replicones autónomos), y que no son indispensables para la viabilidad de la bacteria que los posee. Hay plásmidos crípticos que no dan ningún fenotipo detectable (función desconocida), pero existen muchos plásmidos que codifican funciones como resistencia a antibióticos o a metales pesados, virulencia a plantas o animales, capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, etc.

            Como es lógico, el material genético plasmídico es susceptible de experimentar mutaciones. Pero la posesión de plásmidos por muchas bacterias puede condicionar otro tipo de variaciones genotípicas heredables: la curación, consistente en la pérdida del plásmido, lo que acarrea obviamente la pérdida concomitante de las funciones y fenotipos codificado por aquel, sin que se afecte la viabilidad de la bacteria.

Métodos de curación de plásmidos:

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Sometimiento del cultivo bacteriano a altas temperaturas (cercanas a la temperatura máxima);

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Tratamiento del cultivo con agentes químicos que se intercalan en el ADN, interfiriendo con la replicación, estabilidad o reparto del plásmido a las células hijas (bromuro de etido, naranja de acridina, etc.).

 

NOTAS

[1] Escherichia coli tiene un segmento de ADN invertido respecto de su pariente evolutivo Salmonella typhimurium

[2] Algunas bacterias patógenas han sacado provecho adaptativo de su facilidad para revertir mutaciones de desfase de lectura. Por ejemplo, el agente de la tosferina (Bordetella pertussis) posee genes para algunos componentes de su envuelta cuya secuencia tiene abundantes secuencias repetidas. Ello hace que se den frecuentes mutaciones de desfase y reversiones o nuevas mutaciones. De esta forma, va esquivando la acción defensiva del sistema inmune del huésped.

    [3].- El bromuro de etidio (BrEt) se emplea rutinariamente para teñir los geles de electroforesis de ADN y ARN. Los geles se tratan durante unos minutos con  1mg de BrEt, y luego se iluminan con luz UV. El ADN se visualiza porque el BrEt intercalado en él produce una fluorescencia de color anaranjado-rojizo.

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