1 PREÁMBULO: AVANCE DE CONCEPTOS SOBRE BACTERIÓFAGOS
2 APROXIMACIÓN HISTÓRICA Y CONCEPTOS GENERALES SOBRE LA TRANSDUCCIÓN
4 TRANSDUCCIÓN ESPECIALIZADA (=RESTRINGIDA)
Antes de entrar de lleno en el tema de la transducción, conviene que adelantemos algunas ideas generales sobre los virus bacterianos con genoma de ADN, que nos serán útiles para el presente capítulo.
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El proceso de la infección comienza cuando la partícula del fago se adsorbe sobre receptores en la superficie de la bacteria. |
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Inyecta el ADN contenido en su cápsida. Entrada del ADN fágico a la célula hospedadora. Este ADN tenderá a expresar su programa genético, pero el resultado final dependerá de que el fago sea de tipo virulento o de tipo moderado: |
A. Si el fago es de tipo virulento:
Se expresa el programa genético vegetativo (lítico) de su genomio, destinado a producir muchas copias de ese ADN fágico, y muchas cápsidas proteicas. En el interior de cada cápsida se introduce (“se empaqueta”) una copia del genomio del fago. Las nuevas partículas (viriones), una vez completadas y ensambladas, lisan a la bacteria, quedando libres en el medio y preparadas para infectar nuevas células de la especie bacteriana hospedadora.¡
B. Si el fago es de tipo moderado pueden darse dos alternativas distintas:
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El ADN inyectado expresa su información vegetativa, de modo que se produce un ciclo lítico, productivo de nuevos viriones, similar al descrito para los fagos virulentos; o bien |
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Se pueden reprimir las funciones líticas del fago. En este caso el ADN del fago establece una relación benigna con su hospedador: suele incorporarse por recombinación específica de sitio conservativa (ver tema 17), integrándose en el genóforo bacteriano. A partir de este momento, el ADN del fago (que ahora se llama profago) permanece en esta situación, como una porción más del genomio de la bacteria, replicándose como parte de éste. El profago mantiene reprimidas todas sus funciones líticas (vegetativas), expresando solamente una proteína represora de aquellas funciones (todo esto lo veremos en detalle en la sección de Virología). La célula bacteriana portadora de un profago se denomina lisogénica, y el clon derivado de ella, clon lisogénico. Este tipo de relación benigna es estable, pero de forma espontánea, en algunas de las células del clon lisogénico el profago “despierta” y se activan sus funciones vegetativas: el profago se escinde del genomio bacteriano (de nuevo por recombinación específica) y expresa su programa lítico, que conduce a la producción de nuevos viriones, con lisis de la bacteria. Este fenómeno recibe el nombre de inducción. Artificialmente se puede provocar la inducción de casi todo el cultivo lisogénico, tratándolo con determinados agentes (luz UV, mitomicina, etc.) que dañan el ADN y que inducen el sistema SOS. |
La transducción fue cronológicamente el último sistema de transferencia genética bacteriana que se descubrió.
En 1951 Joshua Lederberg y su colaborador Zinder estaban investigando en Salmonella la posible existencia de un sistema de conjugación al estilo del que se acababa de descubrir en su pariente Escherichia coli (ver capítulo 18). Mezclaron dos cepas de Salmonella, cada una con un juego distinto de marcadores genéticos. (Eureka! Obtuvieron recombinantes. Descartaron que se tratara de transformación, ya que los resultados eran similares si añadían DNasa al sistema. Entonces, ¿era un fenómeno de conjugación? Realizaron el experimento del tubo en “U”, con una membrana separando los dos brazos de la U, en cada uno de los cuales se colocaba una de las cepas. La membrana impide el paso de bacterias y los contactos intercelulares directos entre las dos cepas. Pues bien... seguía habiendo recombinantes. Esto descartaba, pues, que se tratara de conjugación. Se postuló que debía de existir un “agente filtrable” resistente a las nucleasas, responsable último de la transferencia genética.
¿Cuál era la naturaleza exacta del misterioso agente filtrable? Por experimentos independientes se sabía que una de las dos cepas de Salmonella producía un fago (llamado P22), de tipo moderado. Con una serie de ensayos se demostró que era precisamente este fago el responsable de los recombinantes:
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el tratamiento de sobrenadantes de esa cepa con calor o con antisuero provocaba la inactivación tanto del fago como del agente filtrable; |
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las cepas de Salmonella resistentes a P22 (porque no adsorben el fago) no pueden interaccionar con el agente filtrable, y por lo tanto tampoco dan recombinantes; |
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finalmente, se comprobó que la cepa productora del agente filtrable poseía un fago moderado en forma de profago. La inducción de esta cepa lisogénica era la responsable de producir algunas partículas de fagos portadoras de material genético de la cepa de origen, que los fagos inyectaban posteriormente a las células de la cepa receptora. |
Así pues, se acababa de descubrir un nuevo sistema de transferencia genética entre bacterias, sistema que fue bautizado con el nombre de transducción.
La transducción se puede definir como el proceso de transferencia genética desde una célula donadora a otra receptora mediatizado por partículas de bacteriófagos que contienen ADN genómico de la primera. En la transducción podemos distinguir dos estapas diferenciadas:
1. Formación de la partícula fágica transductora: un trozo de material genético de la célula donadora se introduce en el interior de la cabeza de la cápsida de un fago. Las partículas transductoras son en cierta manera “subproductos” anómalos del ciclo normal del fago.
2. La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, donde este ADN puede eventualmente recombinarse y expresar su información.
La transducción descubierta por Lederberg y Zinder se llama transducción generalizada.
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Mediante ella se puede transferir cualquier marcador del genóforo del donador, con aproximadamente la misma frecuencia relativa (de ahí el calificativo de generalizada). |
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La transducción generalizada se produce sólo como consecuencia de infecciones líticas. |
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El ADN del genomio de la bacteria donadora que es introducido en la partícula transductora suele ir sin acompañamiento de ADN del propio fago. Por ello, a esta peculiar partícula consistente en cápsida del fago que encierra sólo ADN genofórico de la bacteria se la denomina pseudovirión. |
Siguiendo con la buena racha de descubrimientos, pocos años más tarde (1956), el mismo Lederberg (esta vez junto con su mujer, y con Morse) hallaron un tipo nuevo de transducción, mientras estaban estudiando el sistema del fago moderado l y su hospedador, E. coli. Este tipo de transducción recibió el nombre de transducción especializada, y sus caracteres distintivos son:
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sólo se transfieren marcadores cromosómicos cercanos al sitio de integración del ADN del fago (profago) en la célula lisogénica (p. ej., en el caso de l, los marcadores gal o bio); |
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se produce únicamente como consecuencia de la inducción de la célula lisogénica por escisión del profago y consiguiente entrada a fase lítica, productora de nuevas partículas de fago; |
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el ADN genómico de la bacteria transportado por la partícula transductora va unido a ADN del fago; |
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la célula transductante se suele convertir en lisogénica para el fago correspondiente. |
Se caracteriza porque en ella se puede transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano, con tal de que tenga un tamaño compatible con la capacidad de “empaquetado” de ADN de la cápsida del fago. La partícula transductora (pseudovirión) se forma por empaquetamiento anómalo de ADN genofórico bacteriano. En el interior de la cabeza del pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago. Las partículas transductoras sólo se forman como consecuencia de infecciones líticas del fago.
Mecanismo de la transducción generalizada promovida por el fago P22 de S. typhimurium.
1ª fase: producción de las partículas fágicas transductoras (=pseudoviriones): Por encapsidamiento ilegítimo de ADN cromosómico. De vez en cuando, el sistema fágico encargado de introducir su ADN en la cápsida (sistema pac), se “equivoca”, y en su lugar introduce un trozo de tamaño equivalente del genóforo de la bacteria donde está teniendo lugar la infección ([1]).
Al parecer, el cromosoma bacteriano contiene secuencias que eventualmente pueden ser reconocidas de vez en cuando por el sistema del fago, de manera que puede introducirse un trozo de ADN de Salmonella en la cápsida.
Al final de esta fase, la célula hospedadora se lisa. El lisado (sobrenadante) contiene una mayoría de viriones auténticos y un pequeño número de pseudoviriones, cada uno con un trozo aleatorio distinto del genomio de la bacteria.
2ª fase: Destino del ADN del exogenote: Mezclemos el lisado obtenido en la fase anterior con un cultivo de la cepa receptora (dotada de marcadores genéticos adecuados). Cada pseudovirión inyecta de forma normal su ADN a una bacteria. Este ADN puede tener varios destinos posibles:
a) puede ser destruido por exo- y endonucleasas citoplásmicas.
b) Puede recombinarse con la región homóloga del genóforo del receptor, mediante la actuación del sistema de recombinación general dependiente de RecA. Se produce una recombinación con dos sobrecruzamientos (“crossing-overs”), que conduce a la integración de doble cadena de ese exogenote, con eliminación de la zona homóloga del endogenote.
c) Puede ocurrir que el exogenote no sea ni destruido ni recombinado; este ADN puede persistir en la célula sin replicarse. La consecuencia de esto es que cuando la célula que originalmente recibió ese ADN exógeno se divida, lo pasará solo a una de las dos células hijas, la cual a su vez la pasará a una hija en la siguiente división, y así sucesivamente. Tenemos, pues, que el exogenote se va diluyendo en el clon por transmisión unilinear: tras varias generaciones, el clon consta de n-1 células sin exogenote y una sola célula con ese exogenote. A este fenómeno se le conoce con el nombre de transducción abortiva, y es más frecuente que la transducción completa derivada de recombinación (más de 90% frente a sólo 1-5%).
La célula que alberga el exogenote abortivo puede expresar los genes de éste: por lo tanto, la célula transductante abortiva contiene proteínas derivadas del exogenote. Parte de las proteínas (en principio la mitad), pasarán a la célula hija que no reciba el exogenote en la siguiente generación. Las hijas de la hija (“las nietas no herederas del original”) reciben la cuarta parte, etc... es decir, aparte de la célula hija que en cada generación hereda el exogenote, sus parientes no-herederos más cercanos reciben proteínas derivadas de la expresión previa de los genes del exogenote. Esto significa que las células no herederas pueden poseer, durante unas pocas generaciones, la función o funciones del exogenote, hasta que el producto correspondiente se diluya o se inactive.
Esto permite detectar fácilmente determinados tipos de transductantes abortivos, distinguiéndolos de los transductantes completos. Por ejemplo, si estamos seleccionando transductantes en base a la adquisición, por parte de una cepa receptora auxotrofa, de la versión silvestre del gen que tiene mutado, sembrando en placas de Petri con medio mínimo, se distinguen dos dos tipos de colonias:
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colonias grandes, correspondientes a transductantes completos; |
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microcolonias, correspondientes a los transductantes abortivos. |
d) Si el exogenote es un plásmido, al llegar a la célula receptora, puede replicarse autónomamente.
e) Si el exogenote contiene un transposón, éste puede insertarse en el genoma de la célula receptora.
No todos los fagos virulentos pueden actuar como mediadores de transducción generalizada. Los fagos con esta capacidad suelen ser aquellos que no degradan totalmente el ADN del hospedador inmediatamente después de entrar (de otra manera, no habría ADN intacto que transducir). Además, su sistema de empaquetamiento de ADN no debe ser muy específico: fagos como el P22 de Salmonella typhimurium o el P1 de Escherichia coli tienen un mecanismo de empaquetado secuencial de unidades de concatémeros, mecanismo que reconoce secuencias que también existen con cierta frecuencia en el genoma del hospedador.
La transducción generalizada ha sido muy útil en el análisis genético de bacterias y la construcción de nuevas cepas. El alumno seguramente estudiará en la asignatura de Genética algunas aplicaciones, incluida la elaboración de mapas de ligamiento. En las prácticas de Virología del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias los estudiantes realizan un interesante experimento de co-transducción que permite aplicar algunas de estas ideas.
Recordemos que fue descubierta por el equipo de Lederberg (1956), mientras hacían experimentos de inducción de células de E. coli lisogenizadas con el fago l. Este tipo de transducción consiste en la transferencia -mediatizada por fagos moderados producidos en la inducción de un cultivo lisogénico-, de un número limitado de marcadores, correspondientes a los loci genéticos adyacentes al sitio de integración del profago. La transducción restringida nunca ocurre por infecciones líticas. El ADN transducido va unido a ADN del fago.
Mecanismo de la transducción especializada promovida por el fago l de Escherichia coli
1ª fase: Producción de los fagos transductores: Supongamos una cepa silvestre de E. coli K12 (l+), o sea, lisogénica para el fago l. Como ya sabemos, el profago se encuentra integrado entre los operones gal y bio.
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Inducimos artificialmente este cultivo lisogénico (tratando, p. ej., con rayos UV, o con mitomicina-C). El profago desreprime sus funciones vegetativas, de modo que va a entrar en un ciclo lítico, comenzando por escindirse del lugar de integración, por medio de una recombinación específica conservativa entre sus extremos (BOP' X POB'). Con una baja frecuencia (10-5-10--6) se producen escisiones anómalas del profago: bucles anómalos, de modo que se forman círculos que llevan una porción adyacente del cromosoma bacteriano (dependiendo de los casos, o gal o bio), y en cambio, queda un trozo del genomio del fago. De esta forma se pueden formar fagos l defectivos (ld) para alguna función fágica, pero con la “contrapartida” de ser portadores de material genofórico de la bacteria hospedadora ([2]). |
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Así pues, de esta forma se obtiene un lisado (llamado lisado LTF, de baja frecuencia de transducción), donde existe una pequeña proporción (alrededor de 10--6) de partículas defectivas del fago portadoras de ADN cromosómico. Estos viriones, por sí solos no podrían establecer lisogenia, pero si en una misma célula inyectaran su ADN un fago defectivo y otro silvestre, este último actuaría como fago auxiliador (“helper”) de modo que el defectivo sí podría entonces establecer lisogenia. A continuación veremos precisamente cada una de estas dos posibilidades. (En ambos casos vamos a suponer que las partículas transductoras portan el operón silvestre gal+, y que empleamos una cepa receptora mutante gal--). |
2ª fase en el caso de infectar una cepa receptora con el lisado anterior a baja multiplicidad de infección: Imaginemos que mezclamos un cultivo de la cepa receptora con un lisado LTF, a una multiplicidad de infección (m.d.i., o en inglés, m.o.i) de alrededor de 1 (o sea, cada bacteria recibe, por término medio una sola partícula de fago).
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Una partícula lgal+ inyectaría de forma normal su ADN en la bacteria gal--. El ADN lineal del fago se circulariza como de costumbre. Pero obsérvese que este ADN no posee un sitio att normal, sino que presenta solamente el sitio BOP' (derivado de la escisión anómala producida en el ciclo anterior), y además, al ser defectivo, cabe la posibilidad de que haya perdido el gen int que codifica la integrasa. En este caso, la única posibilidad de integración del ADN es mediante recombinación homóloga simple (un solo crossing-over) propiciada por el sistema RecA de la bacteria receptora. |
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El resultado de esta recombinación homóloga es la creación de un heterogenote gal+/gal-- con un profago l defectivo, que debido a ese carácter defectivo no es inducible (no provoca lisogenia). Observar que cada copia del gen gal es en realidad un “mosaico”, con una porción derivada del exogenote y otra del endogenote. Este heterogenote con fenotipo Gal+ es estable. |
2ª fase en el caso de infectar la cepa receptora con el lisado LTF a una alta multiplicidad de infección: Imagimenos ahora que mezclamos una media de 10 partículas de fago del lisado obtenido en la primera fase con 1 célula de la bacteria receptora (o sea, una m.o.i.=10).
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Algunas bacterias reciben el ADN del fago defectivo (ldgal+) junto con el ADN del fago silvestre. |
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El ADN del fago silvestre se integraría de la forma habitual, mediante su sistema de recombinación específica de sitio (POP' X BOB'). Este ADN del fago silvestre actúa como auxiliador respecto del defectivo: le suministra sitios para la recombinación y la función de la integrasa. Por lo tanto, a continuación se produce otro evento de recombinación específica entre ambos ADN de l. |
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El resultado es un heterogenote gal+/gal-- que es doble lisogénico (l+/ld). Su fenotipo sería Gal+ y l+, capaz de producir, por inducción partículas de fago silvestres y defectivas. |
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Supongamos que inducimos ahora este clon doble lisógeno: se producen dos bucles en cada célula, uno que regenera el genomio circular del l silvestre, y otro que origina el de ldgal+. Observar, pues, que el resultado de esta inducción es un lisado donde existe un 50% de l+ y un 50% de fagos portadores del gen gal+. Si este lisado lo usamos para infectar de nuevo una cepa gal--, la proporción de transductantes Gal+ será muy alta. Por esta razón, al lisado obtenido por inducción del doble lisógeno l+/ld se le denomina lisado HTF (alta frecuencia de transducción). |
La transducción especializada con el fago l permitió los primeros aislamientos (“clonaciones”) de genes in vivo, pero por supuesto, desde mediados de los años 70 la clonación de genes se realiza ya con métodos de ADN recombinante (ingeniería genética).
