ÍNDICE

1          CONCEPTO Y APROXIMACIÓN HISTÓRICA

            La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de información genética desde una célula donadora a otra receptora, promovido por determinados tipos de plásmidos, y que requiere contactos directos entre ambas, con intervención de estructuras superficiales especializadas y de funciones específicas.

            El descubrimiento de la transformación había revelado ya la existencia de recombinación genética entre porciones de genomios bacterianos. En mitad de los años 40, la pregunta que se planteaba era: ¿existe algún tipo de recombinación bacteriana que suceda al estilo de la reproducción sexual de los eucariotas?

            Se descubrió que ciertas bacterias presentan una forma de recombinación que recordaba en algunos rasgos a la sexualidad: un tipo de célula donadora (“macho”) donaba directamente parte de su material genético a otro tipo (la receptora, equivalente a la “hembra”), con ulterior recombinación entre ambos. A este fenómeno se le denominó conjugación, por su similitud aparente con lo que sucede en eucariotas. Sin embargo, como veremos enseguida, la conjugación no es una forma auténtica de sexualidad al estilo de los eucariotas.

            Con la perspectiva de los años, se puede decir que el descubrimiento de la conjugación bacteriana fue uno de los más fortuitos, pero al mismo tiempo, de los más felices y trascendentales de toda la Biología del siglo XX. Muchos biólogos habían intentado infructuosamente demostrar conjugación de tipo “sexual” en bacterias. Lederberg y Tatum (1946), que a la sazón investigaban en la Universidad de Yale, tuvieron la enorme suerte de “escoger” (sin saberlo a priori) una de las pocas especies bacterianas (Escherichia coli) que presentan sistemas naturales de conjugación, y aún más, la cepa concreta denominada K12, que llevan uno de estos sistemas... Pero todavía mejor: como se descubriría muchos años después, el sistema conjugativo de dicha cepa es casi único por su capacidad de conjugación permanente, no estando sometido a los controles negativos típicos de la inmensa mayoría de los demás sistemas que luego se descubrieron. En resumen, un extraordinario “golpe de suerte” en el año 1946 dio el “pistoletazo de salida” para una de las épocas más gloriosas de la Biología, contribuyendo de modo excepcional al origen de la Biología Molecular.

             A continuación expondremos los hitos más importantes en el estudio de la conjugación en Escherichia coli K12 (consulten los esquemas).

1.1        EXPERIMENTOS DE LEDERBERG Y TATUM

            Joshua Lederberg y Edward Tatum (1946) mezclaron dos cepas doblemente auxotrofas, dotadas de distintos marcadores genéticos:

¿Qué proceso de transferencia genética había dado origen a los recombinantes? Se descartó que fuera por transformación:

            En ulteriores experimentos se comprobó que existían dos tipos de cepas de cara a la producción de recombinantes:

Los cruces de tipo F⁺ x F^-- dan origen a recombinantes;

Los cruces de tipo F^--x F^-- no dan origen a recombinantes.

Por otro lado, se observaron dos importantes propiedades de los cruces F⁺ x F^-:

            El origen de ambos fenómenos estriba en la posesión, por parte de las células F⁺, del llamado “factor sexual o factor de fertilidad F”, (que hoy sabemos que es un plásmido, pero tal extremo se desconocía aún en esa época). Por lo tanto, de alguna manera el factor F debía de tener la doble capacidad de transferirse con alta frecuencia (casi el 100%) a las células F^--, y de dar origen en ellas a recombinantes, pero con mucha menor frecuencia (10^--5). ¿Cómo explicar esta doble capacidad del factor F, con dos frecuencias tan diferentes? Las bases para la respuesta a esta pregunta fueron colocadas en el siguiente gran capítulo de esta historia:

1.2        AISLAMIENTO DE LAS CEPAS Hfr POR LEDERBERG Y HAYES

            En los años de 1950 Joshua Lederberg y William Hayes, cada uno por separado, aislaron un nuevo tipo de cepas fértiles a partir de las cepas F⁺ originales, cuyas propiedades distintivas respecto de las cepas F⁺ eran:

a)      Provocaban fertilidad (o sea, daban recombinantes al cruzarlas con F^--) con una frecuencia muy alta (unas 1000 veces superior a la de las cepas F⁺). Por ello, el nombre que se dio a este nuevo tipo de cepas fértiles fue el de Hfr (iniciales, en inglés, de alta frecuencia de recombinación).

b)      A diferencia de las F⁺, las cepas Hfr no suelen convertir en fértiles a las cepas F^-- tras el cruce conjugativo con ellas.

            Entonces, la pregunta obvia era: ¿qué relación existe entre las células Hfr y las células F⁺ de las que parecen derivar?

1.3        EL MODELO DE CAMPBELL

            Alan Cambell propuso en 1962 un modelo hipotético que posteriormente se vio confirmado por otros experimentos, y que daba cuenta del comportamiento de las cepas F⁺ de Lederberg y de las Hfr de Lederberg y Hayes:

            El análisis del proceso de conjugación y de la transferencia de marcadores cromosómicos se vio grandemente impulsado una vez disponibles las cepas Hfr puras. Se fueron obteniendo diversas cepas Hfr, cada una de las cuales se caracterizaba por una mayor eficiencia de transferencia de determinados marcadores. El siguiente gran avance en el estudio de la conjugación se produjo trabajando sobre una de estas cepas, la denominada HfrH (la “H”, en honor de Hayes):

1.4        EXPERIMENTOS DE LOS CRUCES INTERRUMPIDOS DE JACOB Y WOLLMAN

            Estos autores, que trabajaban en el Instituto Pasteur de París, realizaron a partir de 1956 una importantísima serie de experiencias, que demostraron que la transferencia conjugativa tiene una polaridad (un sentido determinado): la transferencia de ADN por cada cepa Hfr es unidireccional y linear, o sea, los genes del donador van entrando al receptor en un orden determinado.

            De la representación gráfica de porcentaje de recombinantes (eje de ordenadas) en función del tiempo de conjugación (abscisas) se deduce lo siguiente:

1.      Cuanto más tiempo se deja la conjugación sin interrumpir, más material genético se transfiere.

2.      Los genes van entrando ordenada y secuencialmente. La frecuencia relativa obtenida para cada marcador (es decir, el nº final de recombinantes) está en relación (inversa) con el tiempo en que éste comienza a aparecer (a menor tiempo de aparición, mayor frecuencia final de ese marcador). Cada marcador tiene un tiempo de entrada inicial característico (que en la gráfica se manifiesta por el punto del eje de abscisas cortado por la curva).

3.      Cada marcador da una curva con una pendiente característica. El hecho de que exista pendiente (y no que exista una recta en vertical desde el momento de aparición del marcador) implica que cada marcador no entra a la población de bacterias receptoras “de un tirón”, sino que algunas células lo reciben antes y otras después, dentro de un cierto rango de tiempos. La existencia de una meseta final significa que a partir de un punto ya no entra más marcador (es decir, ya se ha producido toda la transferencia de ese marcador).

            Resumiendo las consecuencias de este experimento: En la conjugación Hfr x F^-- el cromosoma entra en la célula receptora con una orientación determinada, de modo que los genes entran ordenada y secuencialmente. El tiempo en que comienza a detectarse un determinado marcador, así como la frecuencia final de dicho marcador en los transconjugantes dan una estimación de su distancia respecto del origen de transferencia. La correlación entre tiempo de aparición y frecuencia final del marcador sugiere que las parejas de cruce donador-receptor se separan espontáneamente en algún momento de la conjugación; de no existir tal separación espontánea, se terminarían obteniendo frecuencias del 100% para cada marcador individual, incluidos los más alejados del origen de transferencia.

2          ESTUDIO DE LA CONJUGACION PROMOVIDA POR EL PLASMIDO F DE E. COLI

2.1        DESCRIPCIÓN DEL PLÁSMIDO F Y DE SUS FUNCIONES BÁSICAS

             El factor responsable de la fertilidad de E. coli K12, o sea, el plásmido F, es un ejemplo de plásmido conjugativo que tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma bacteriano para integrarse en él (episoma). El factor F puede encontrarse en uno de tres posibles estados:

En estos tres estados realiza el mismo tipo de funciones esenciales.

Estructura física:

Organización genética y funcional: Se han identificado unos 60 genes en el plásmido F. Vamos a echar una ojeada al mapa de F para describir los principales grupos de genes según las funciones que realizan:

1)      Porción tra (genes que codifican funciones relacionadas con la transferencia conjugativa). Existen unos 25 genes tra, repartidos en unas 33 kb (o sea, casi la tercera parte de F está dedicado a genes de conjugación). La mayor parte de esos genes están formando parte de un gran operón traY……Z (unos 20 genes). Los genes tra se pueden clasificar en:

a)      Necesarios para la biosíntesis y ensamblaje de los pelos sexuales. Entre ellos está el gen traA, que codifica la pre-propilina, es decir, el precursor que por maduración se convertirá en la pilina F, la proteína constitutiva de los pelos sexuales de tipo F. Otros genes tra intervienen en la maduración de la pilina, y en el ensamblaje de las subunidades para dar el pelo F.

b)      Estabilización de los agregados de conjugación: traG, traN.

c)      Metabolismo del ADN durante la conjugación: traI, traD, traM, traY, traZ.

d)      Regulación genética de la transferencia: traJ determina un activador transcripcional del gran operón traY…Z; finP, finO formarían un sistema de control negativo sobre el gran operón traY...Z, pero como veremos, este sistema no es funcional en el plásmido F debido a que el finO tiene una inactivación insercional permanente por la secuencia de inserción IS3.

e)      Exclusión de superficie: traS, traT.

2)      Regiones para la replicación vegetativa del plásmido F: la zona RepFIA es la más importante, y posee genes relacionados con la replicación vegetativa, con la incompatibilidad de F respecto de otros plásmidos (Inc) de tipo similar, y con el reparto de las copias replicadas de F a las células hijas.

3)      Existen varias secuencias de inserción: dos copias de IS3, una copia de IS2 y una copia de Tn1000 (antes llamado gd, y que pertenece a la misma familia que los transpones Tn1, Tn3, etc). Precisamente son estas secuencias de inserción las que permiten la integración de F en varios lugares del cromosoma, por medio de recombinación homóloga con elementos similares del genóforo bacteriano. Aludiremos a esto de nuevo, cuando tratemos el origen de las cepas Hfr y de las cepas F'.

4)      Observen que existen dos secuencias ori (es decir, orígenes de replicación). Una de ellas, la oriV actúa como origen de replicación vegetativa, y la otra (oriT, de unas 300 pb) es el origen para la transferencia conjugativa, que como veremos enseguida, implica un tipo especial de replicación.

2.2        FISIOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CONJUGACIÓN

Podemos distinguir en la conjugación dos grandes fases:

1)      contactos entre células F⁺ (o, en su caso, Hfr) y F^--;

2)      transferencia del ADN.

2.2.1        CONTACTOS ENTRE CÉLULAS F⁺ Y F^--

            Las células F⁺ (o las Hfr) forman de 1 a 10 pelos sexuales (repasar aquí lo que se dijo oportunamente en el cap. 8 sobre este tipo de pelos, que son distintos de las fimbrias de tipo adhesivo). El pelo interacciona específicamente, a través de su punta, con un receptor de la célula F^-- (concretamente, parece ser que se trata de la proteína OmpA, de la membrana externa).

            En los cruces se ha visto que más que parejas de cruce existen agregados de cruce, donde varias células de ambos tipos (hasta unas 20) se encuentran relacionadas por contactos directos. Las cosas ocurren de la siguiente manera:

1)      Una célula F⁺ contacta por medio de la punta de su pelo F con el receptor de superficie de una F^--.

2)      El pelo F se va despolimerizando desde su base, lo cual provoca la apariencia de que se va retrayendo. En ese movimiento de retracción, la célula F^-- se va acercando a la F⁺.

3)      Cuando el pelo se termina de desintegrar, las células se ponen en contacto directo pared-pared. Se forma un puente conjugativo que pone en contacto los citoplasmas de ambas células.

4)      Las parejas o agregados de cruce se estabilizan por la acción de los genes traN y traG del plásmido F, y de ompA de la célula F^--.

5)      La proteína producida por traD (localizada en ambas membranas, citoplásmica y externa) parece que facilita el transporte del ADN a la célula receptora.

6)      Tras cierto tiempo de conjugación, el agregado se desagrega de forma activa.

            Aquí hablaremos de un fenómeno interesante, que tiene que ver con las interacciones entre superficies celulares: se trata de la exclusión superficial, y consiste en un sistema por el que se evita que las células de tipo F⁺ puedan actuar como receptoras frente a otras F⁺. Se sabe que la acción de dos genes del plásmido F realizan esta función:

            Otro fenómeno que se puede observar en los cruces F⁺ x F^-- es la zigosis letal. Ocurre cuando la proporción de células F⁺ es muy superior a la de F^-- (p. ej., de 10:1). En este caso, las células receptoras pueden morir, debido a que están siendo modificadas en muchos puntos de su superficie por numerosos contactos con células F⁺.

2.2.2        TRANSFERENCIA Y PROCESAMIENTO DEL ADN CONJUGATIVO

            La transferencia de ADN desde una célula F⁺ a una F^-- es un proceso especial de replicación asimétrica por círculo rodante.

Por lo tanto, la transferencia de ADN no implica que la doble hélice de F desaparezca del donador para aparecer en el receptor, sino que al final, ambos miembros de la pareja poseen un plásmido F completo.

            Resumiendo el modelo que explicaremos luego, la transferencia conjugativa del plásmido F ocurre de la siguiente manera:

            Veamos el modelo actualizado que incorpora lo que se conoce de este proceso (aunque por supuesto, aún quedan puntos hipotéticos por aclarar):

1)      Corte específico de una de las cadenas de F a nivel de la secuencia oriT ([1]). El corte lo realiza el complejo {TraY+TraZ}, que se localiza anclado en el poro o canal de conjugación. Así pues, este complejo actúa en este momento como una endonucleasa específica que corta en una sola de las cadenas de F, dentro de la secuencia oriT.

2)      El producto del gen traM suministra la señal, por un mecanismo desconocido, para desencadenar la transferencia.

3)      El extremo 5' generado en el corte a oriT entra a la célula receptora, pero dicho extremo permanece unido al complejo {TraY+TraZ}. La transferencia progresa en el sentido 5' à3'. El complejo {TraY+TraZ} actúa ahora como una helicasa de tipo I, de modo que va desenrollando la doble hélice del F, separando las dos hebras, e hidrolizando ATP simultáneamente (o sea, la helicasa de F es una ATPasa dependiente de ADN). De esta forma se va desenrollando la doble hélice a razón de unas 1200 pb/ seg.

4)      Síntesis cnjugativa del ADN: Se producen dos procesos simultáneos de síntesis de ADN, uno en cada célula:

a)      Síntesis de la cadena de reemplazo del donador (SCRD): esta síntesis opera de modo continuo (sería equivalente a la síntesis de la cadena adelantada de la replicación normal). Esta síntesis se inicia a partir de un ARN cebador (“primer” en inglés) sintetizado por un primosoma que reconoce una secuencia (n') situada cerca de oriT.

b)      Síntesis de la cadena complementaria en el receptor (SCCR): a diferencia de la anterior, es discontinua, a base de fragmentos de Okazaki (por lo tanto, sería la equivalente de la síntesis de la cadena retrasada).En ambos casos parece ser que el primosoma responsable de los ARN cebadores no es exactamente idéntico al que se emplea en la replicación “normal”, sino que está modificado por alguna función específica codificada por el plásmido F (una primasa específica del factor F).

5)      Circularización del ADN transferido y replicado, y adquisición de configuración final: No se sabe exactamente cómo ocurre la circularización (o sea, cómo se vuelven a ligar los extremos generados por la rotura descrita en el apartado 1º). Parece ser que el complejo {TraY+TraZ} “guarda” la energía del enlace fosfodiéster que él corta (conservándola al unirse con el ADN cortado), y luego la vuelve a emplear para “sellar” el corte una vez que las cadenas han sido replicadas-y-transferidas (o sea, el complejo actuaría al final como una “ADN-ligasa”). Posteriormente, sobre esta molécula circular cerrada covalentemente (c.c.c.) y aún “relajada”, actúa la ADN-girasa, introduciendo superenrollamiento negativo. En esta configuración, el plásmido F queda intacto y funcional en el transconjugante.

6)      En el caso de cruces Hfr x F^--, al menos una parte del fragmento cromosómico “arrastrado” desde el donador al receptor se recombina, con un doble sobrecruzamiento (por el sistema de RecA) con la porción homóloga del endogenote, lo que lleva a sustitución de unas secuencias por las otras.

2.3       REGULACION GENÉTICA DE LA CONJUGACION

            La mayor parte de los plásmidos conjugativos (pero curiosamente no el F) tienen un control negativo de su transferencia, de modo que sólo se transfieren a alta frecuencia durante unas pocas generaciones, al cabo de las cuales se establece una baja frecuencia de conjugación([2]). El resto del tiempo, los genes tra están reprimidos.

            Vamos a referirnos a un plásmido que sí tiene control negativo: el R1, perteneciente a otro grupo de incompatibilidad (IncFII) distinto del F, pero que por lo demás tiene funciones similares:

            La regulación negativa se produce por la acción de los genes finO y finP, e implica un mecanismo basado en ARN regulatorio antiparalelo (antisentido).

            La superposición de un sistema de regulación positiva (por traJ) con otro de regulación negativa (por finO + finP) es la responsable de una importante característica de muchos plásmidos conjugativos: su dispersión esporádica de tipo epidémico entre poblaciones bacterianas:

Significado adaptativo de este sistema de control: Como acabamos de exponer, este sistema asegura la rápida dispersión epidémica de los plásmidos, de modo que la represión de la transferencia se produce coincidiendo con la situación en la que de hecho el plásmido conjugativo ha “invadido” toda o casi toda la población, ahorrándose la energía y materiales que tendría que dedicar a fabricar pelos sexuales y demás funciones conjgativas en unas circunstancias en las que serían superfluos.

            Pero además, como se recordará, los pelos sexuales son la zona de reconocimiento de una diversidad de fagos (p. ej., para los pelos F existen diversos fagos icosaédricos de genomio ARN que se adsorben a los laterales del pelo, y fagos filamentosos de ADN que comienzan su infección uniéndose a la punta del pelo sexual). Cabe imaginar que la represión de las funciones tra (entre ellas, claro está, la fabricación del pelo) son una ventaja para la bacteria, al evitar que durante la mayor parte del tiempo puedan iniciar la infección dichos fagos específicos.

3          INTERACCIONES DEL PLÁSMIDO F CON EL CROMOSOMA

3.1        FORMACIÓN Y CARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS Hfr

            Como ya dijimos, el plásmido F puede pasar desde su estado autónomo a un estado integrado en el cromosoma bacteriano (episoma), lo que es el origen de la creación de las cepas Hfr. Veamos ahora la base genético-molecular de este proceso:

             Se da una recombinación entre secuencias homólogas presentes simultáneamente en el plásmido F y en el cromosoma, que son secuencias de inserción. Concretamente, en F existen 2 copias de IS3, 1 copia de IS2 y una copia de Tn1000 (que hasta hace poco se denominaba gd), y en el cromosoma hay varias copias de IS. Esta recombinación se da principalmente debido a la actuación del sistema de recombinación homóloga (dependiente de RecA), de modo que las IS funcionan aquí como regiones portátiles de homología implicadas en eventos de recombinación homóloga con un sobrecruzamiento (“crossing-over”) sencillo. Sin embargo, en las cepas mutantes recA^--, la recombinación puede tener lugar por el sistema de recombinación ilegítima propio de los elementos transponibles (el mecanismo sería el de la fusión de replicones, al que aludimos cuando estudiamos la transposición). En cualquiera de los dos casos, el plásmido integrado, es decir, el episoma, aparece “emparedado” entre dos copias de la IS implicada en la recombinación.

            Cada recombinación origina una Hfr distinta, dependiendo de las secuencias IS implicadas, de su localización dentro del cromosoma de E. coli, y de la orientación. Ya dijimos que se han identificado unas 22 cepas Hfr distintas, y que existen ejemplos de parejas de Hfr que transfieren cromosoma a partir del mismo punto cromosómico, pero en orientaciones opuestas.

            Recordemos de nuevo que las Hfr codifican todas las funciones del plásmido F. Al promover la transferencia conjugativa, “arrastran” al cromosoma desde el oriT. Para que se transfiriera todo el cromosoma, la pareja de cruce debería permanecer unida 100 minutos, y en ese caso, lo último que se transfiere es la porción del plásmido F que queda al otro lado de oriT (y que es la que lleva la región tra). Pero como dijimos, ello ocurre raramente (porque antes las parejas de cruce se deshacen espontáneamente), y por lo tanto, esta es la razón de que en los cruces HfrXF^-- los transconjugantes siguen siendo F^--.

            Así pues, en la mayer parte de los cruces HfrFXF^--, lo que se transfiere (el exogenote) es un fragmento más o menos largo de ADN cd lineal del donador, encabezado por una parte del plásmido F y seguido por un trecho de cromosoma. Este fragmento no tiene capacidad de replicación autónoma, y su destino será perderse a no ser que se recombine con alguna porción homóloga del endogente. Si ocurre esa recombinación, y suponiendo (como ocurre en los experimentos) que donador y receptor tienen marcadores distintos, nosotros detectamos eso precisamente por la alta frecuencia de recombinantes entre la población de transconjugantes receptores. No hace falta insistir (ya lo vimos en los experimentos de Jacob y Wollman) que para cada cepa Hfr existe un “gradiente” de marcadores transferidos, según su frecuencia final en los transconjugantes, que a su vez se correlaciona con el tiempo de entrada al receptor (siendo esto la base de la elaboración de mapas genéticos por conjugación).

3.2        REVERSIÓN DE LAS CEPAS Hfr, ORIGEN DE LAS F', Y SEXDUCCIÓN

             La cepa Hfr puede revertir a F⁺, por una escisión precisa (exacta), que implica los extremos del factor integrado (las secuencias IS que lo “emparedan”). Cada cepa Hfr concreta presenta una frecuencia característica de reversión a F⁺. Algunas cepas son muy inestables, de modo que revierten frecuentemente, lo que obliga a purificarlas continuamente en el laboratorio para evitar que al final se obtenga una población F⁺. En cambio, otras cepas son muy estables. La cepa HfrC es la más estable, de modo que raramente revierte por escisión.

            Pero también pueden ocurrir escisiones imprecisas (en las que están implicadas secuencias repetidas diferentes a las IS que flanquean al episoma), de modo que el factor F adquiere trozos de genomio bacteriano adyacentes al lugar donde estaba integrado. Estos plásmidos F autónomos que adquieren e incorporan permanentemente un trozo de genomio bacteriano, se denominan F' (F-primas). Dependiendo de qué se lleva en su escisión anómala se pueden distinguir:

1)      Escisiones que dejan parte de F en el genóforo pero que adquieren genes a uno u otro lado del sitio original de inserción: generan las F' de tipo I, que a su vez pueden ser:

a)      F’ de tipo Ia: adquiere genes del lado proximal (o sea, aquellos que la cepa Hfr original transfería en primer lugar);

b)      F' de tipo Ib: adquiere genes del lado distal (los que se transferían tardíamente por la cepa Hfr original).

2)      Escisiones que no dejan ninguna porción de F en el genomio bacteriano, pero que incorporan genes a ambos lados del sitio de inserción original: generan F' de tipo II.

             A las cepas donde se genera originalmente cada F' concreto se las llama con el nombre de cepas F' primarias. Cada plásmido F' porta un segmento concreto y discreto de cromosoma, que dependiendo de la cepa puede tener una longitud de hasta el 25% del cromosoma bacteriano. Observen que una cepa F’ primaria tiene una delección en su cromosoma, pero esa delección no es letal, porque el trozo de ADN escindido sigue en la célula, aunque formando parte ahora del F prima.

             Si realizamos un cruce F' x F^--, la célula receptora adquiere ese plásmido F', y por lo tanto, los genes bacterianos portados por dicho F'. Esta es la base del siguiente concepto:

3.3        SEXDUCCIÓN

            La sexducción consiste en el transporte de material genético desde una célula a otra por medio de plásmidos F'. Sus caracteres distintivos respecto de los cruces F⁺ x F^-- y de los Hfr x F^-- son:

            Las cepas generadas por transferencia a ellas de un F' desde una cepa F' original se denominan F' secundarias. Tras la sexducción, si la cepa receptora es recA⁺, se produce una recombinación entre segmentos cromosómicos (procedentes de la célula donadora) portados por el F' y marcadores cromosómicos homólogos de esa cepa receptora. Se origina una cepa parecida a las Hfr (pero que no se ha producido por recombinaciones a través de las IS), que es merodiploide (diploide parcial) por recombinación, y no un recombinante por sustitución.

            Si se cura una cepa F' primaria de su plásmido F', obviamente quedará sin los genes cromosómicos que había “secuestrado” el factor F'. Si dichos genes eran esenciales para la viabilidad celular, el resultado es que la célula muere. Si no eran esenciales, se producirá la pérdida de funciones correspondientes, con la pertinente alteración del fenotipo.

            El uso de factores F-primas fue muy útil durante muchos años para hacer análisis genéticos en bacterias (por ejemplo, muchos de los datos sobre el operón lac de Escherichia coli se obtuvieron con F-primas, lo cual permitía realizar pruebas de complementación cis-trans). Sin embargo, actualmente, al igual que otras técnicas in vivo desarrolladas durante la “edad de oro de la genética molecular” (años 50-60), han sido prácticamente desplazadas por los métodos de Ingeniería Genética.

4          ALGUNAS IDEAS ADICIONALES SOBRE BIOLOGÍA DE LOS PLÁSMIDOS

            Vamos a concluir el presente capítulo con una rápida visión de algunos aspectos importantes de la biología de los plásmidos, deteniéndonos en algunos sistemas plasmídicos distintos al tipo del factor F que acabamos de estudiar.

4.1        TIPOS DE PLÁSMIDOS

            Existe una amplia variedad de plásmidos. Los plásmidos bacterianos son de muchos tipos distintos, pero a grandes rasgos podemos clasificarlos atendiendo a diversos caracteres:

1)      Según que sean autotransmisibles por conjugación o no:

a)      plásmidos conjugativos

b)      plásmidos no-conjugativos. Dentro de esta categoría se incluyen:

i)        plásmidos no movilizables

ii)       plásmidos movilizables por otros que sí son conjugativos.

2)      Según su control de replicación vegetativa:

a)      Plásmidos de control estricto del número de copias: tienen bajo número de copias por cromosoma en la misma célula. Suelen ser plásmidos de tamaños medianos (unas 30 kb) a grandes (cientos de kb) P. ej., el factor F se mantiene a 1-2 copias por cromosoma.

b)      Plásmidos de control relajado: alto nº de copias por cromosoma (más de 10). Suelen ser plásmidos pequeños (menos de 10 kb). Algunos de ellos tienen un sistema de replicación especial, y son amplificables cuando a las bacterias que los poseen se les añade cloramfenicol: este antibiótico detiene la síntesis de proteínas, lo que afecta a la replicación del cromosoma, ya que para que se inicie cada ciclo de replicación cromosómica se necesita un nuevo “pool” de determinadas enzimas. Pero esto no afecta a la replicación del plásmido, que de este manera se “amplifica” y aumenta aún más su proporción respecto del cromosoma.

3)      Según el tipo de fenotipos que codifican (y dejando aparte a los plásmidos crípticos, de los que se desconoce su función fenotípica):

a)      Plásmidos R, que codifican una o más resistencias a drogas (antibióticos) y/o resistencia a metales pesados.

b)      Plásmidos bacteriocinogénicos, que codifican alguna bacteriocina y simultáneamente confieren inmunidad frente a esa bacteriocina a la bacteria que lo posee. Dentro de ellos, de los más estudiados son los plásmidos Col, que producen colicinas (bacteriocinas de E. coli).

c)      Plásmidos de virulencia, que codifican funciones relacionadas con la virulencia en muchas bacterias patógenas. Por ejemplo:

i)        plásmido de la toxina tetánica en Clostridium tetani.

ii)       plásmido de la toxina del ántrax en Bacillus anthracis.

d)      Plásmidos que codifican factores de colonización (para la invasión de los tejidos de su hospedador).

e)      Plásmidos de cepas de Pseudomonas, que confieren rutas metabólicas capaces de utilizar como fuentes de carbono y energía sustancias que otros organismos no pueden catabolizar:

i)        plásmidos OCT (degradación del octano);

ii)       plásmidos  TOL/XYL (degradación del tolueno y xileno);

iii)     plásmidos NAF (degradación del naftaleno), etc.

f)        Plásmidos de cepas de Rhizobium responsables de funciones relacionadas con el establecimiento de las simbiosis fijadoras de nitrógeno en los nódulos radicales de las leguminosas (pSym y otros tipos).

g)      Plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium, responsables de la producción de tumores en numerosas plantas dicotiledóneas.

h)      Existen igualmente plásmidos que codifican más de un tipo de fenotipos: p. ej., plásmidos que suministran resistencia a antibióticos y capacidad de virulencia.

4)      Plásmidos según el grupo de incompatibilidad. Recordar la definición de incompatibilidad entre plásmidos que se dio oportunamente, y la base de este fenómeno: dos plásmidos son incompatibles (no pueden permanecer establemente en la misma célula) porque comparten un mismo sistema de replicación y segregación de las copias. Como se sabe, los plásmidos se pueden clasificar según su pertenencia a un mismo grupo de incompatibilidad.

a)      Así p. ej., el plásmido F pertenece al llamado grupo IncFI;

b)      Los plásmidos R1 y R100, de resistencia a antibióticos, pertenecen al grupo IncFII.

Obsérvese que dos plásmidos conjugativos pertenecientes a grupos de incompatibilidad diferentes pueden poseer regiones tra semejantes, y tipos de pelos sexuales parecidos. Esto es precisamente lo que ocurre con el F comparado con el R1 o el R100.

4.2        MÁS IDEAS ACERCA DE PLÁSMIDOS EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

            En Gram negativas existe una muy amplia variedad de plásmidos. Podemos encontrar ejemplos de plásmidos conjugativos, aunque no todos basados en el sistema que hemos estudiado para el factor F. Muchos plásmidos conjugativos poseen pelos de tipo F (por ej., los ya citados R1 y R100), pero existen otros tipos de sistemas, con sus correspondientes clases de pelos sexuales. p. ej., el plásmido colicinogénico ColE1 posee pelos de tipo “I”.

            Existen muchos casos de plásmidos no conjugativos, pero algunos de ellos pueden ser transferidos a cepas receptoras cuando “conviven” en la célula donadora con otro plásmido conjugativo capaz de movilizarlos. Ello suele deberse a que estos plásmidos no autotransmisibles pero movilizables carecen de la región tra, pero poseen una región denominada mob (del inglés “mobilizable”), que es reconocida por proteínas Tra de conjugación suministradas en trans por el plásmido movilizador, aunque la región mob del plásmido movilizable suministra una región en cis (la secuencia oriT) y un par de funciones en trans (la endonucleasa específica que actúa sobre oriT , y una helicasa).

            En algunas bacterias Gram negativas, p. ej., en cepas de Pseudomonas existe un tipo especial de plásmido conjugativo, que tiene la facultad de transferirse a sí mismo y transferir cromosoma entre una amplia variedad de bacterias Gram negativas, incluyendo entre géneros muy diferentes. A esta clase de plásmidos se le ha dado el nombre de plásmidos promiscuos, y se han usado mucho para realizar mapeos y análisis genéticos en bacterias que por sí mismas carecen de sistemas naturales de conjugación. Ejemplos:

            La existencia de plásmidos conjugativos, promiscuos o no, y de plásmidos no conjugativos pero movilizables, explica la rápida diseminación de muchos plásmidos de resistencia a antibióticos a una amplia diversidad de bacterias, incluyendo importantes patógenas, lo que hace cada vez más difícil la lucha por quimioterapia contra estas últimas. De hecho, un importante problema sanitario lo suministran estas cepas multirresistentes, muchas de las cuales están “acantonadas” en los ambientes hospitalarios, donde la presión selectiva es grande. A continuación nos detendremos precisamente en un comentario sobre los plásmidos R, su significado evolutivo y su importancia epidemiológica.

4.3        PLÁSMIDOS R

            Los plásmidos de resistencia a antibióticos (plásmidos R) fueron descubiertos en los años 50 en Japón, cuando se investigaban cepas de Shigella multirresistentes (Cm^r, Sm^r, Su^r, Tet^r) que habían empezado a aparecer y proliferar, de modo que en pocos años se diseminaron rápidamente por todo el primer mundo. Enseguida se encontraron en numerosos países cepas de E. coli y de otras enterobacterias con plásmidos similares.

            Del intenso estudio a que han estado sometidos estos plásmidos desde entonces se deduce que los plásmidos R son “maleables” y que evolucionan rápidamente ante la presión selectiva. Con las modernas técnicas de Ingeniería Genética y de secuencición de ADN ha sido posible medir el grado de similitud de los genes plasmídicos de resistencia a antibióticos procedentes de bacterias muy diferentes, y de orígenes geográficos muy alejados entre sí, deduciéndose que estos genes han debido de “pasar” de forma epidémica de unas cepas a otras, entre especies y géneros muy distintos (“transmisión horizontal” de información genética). Un mismo gen, conservado en su secuencia en especies muy alejadas, puede sin embargo estar situado en plásmidos de diferentes tipos y grupos de incompatibilidad. Esto ya es un indicio de que los plásmidos R son bastante “moldeables”, y que han venido evolucionando rápidamente desde que el hombre introdujo los quimioterápicos a mediados de este siglo.

            Para hacernos una idea concreta del tipo de procesos implicados en este gran “experimento de evolución bacteriana” desencadenado por el hombre, veamos la estructura del ya citado plásmido R1, un típico plásmido R conjugativo.

Observen en los mapas genéticos que posee dos grandes regiones, denominadas determinantes (det):

            Veamos en más detalle el determinante “r”. Comprobaremos que está compuesto de “módulos”, algunos de los cuales son transposones. El determinante “r” como un todo está limitado por dos copias directas del IS1. Existe dentro un transposón, el Tn4, que codifica Sm^r y Su^r, pero a su vez, dentro de él se insertó otro transposón, el Tn3 (que codifica Amp^r). Por fuera del “doble transposón” Tn4-Tn3 encontramos más genes de resistencias: Cm^r (a la izquierda), y Kan^r, Neo^r. Las copias de IS1 hacen que todo el determinante “r” se comporte a su vez como un enorme transposón compuesto:

Consecuencias evolutivas y epidemiológicas: Aunque en la naturaleza, e independientemente de la acción humana, ya existían plásmidos R antes de la era de los antibióticos, está claro que desde el uso masivo de los quimioterápicos se ha originado un aumento espectacular del número de cepas bacterianas portadoras de plásmidos R, así como el hecho de que los R que se están aislando recientemente llevan mayor número de genes de resistencia, lo que está dificultando los tratamientos de ciertas enfermedades infecciosas.

            Estamos ante un espectacular “experimento” de genética de poblaciones, en el que la acción humana ha llevado a la supervivencia y prevalencia de las cepas bacterianas más aptas, por adaptación evolutiva frente a una fuerte presión selectiva.

            Para ilustrar esto, basta hacer una sencilla comprobación: si se trata a un paciente con tetraciclina, al cabo de una semana las cepas de E. coli que se aislen de sus heces serán casi en su totalidad Tet^r.

            Está claro que la prescripción y uso indiscriminado de antibióticos como terapia provoca una presión selectiva que favorece la prevalencia de cepas portadoras de plásmidos R, que van “incorporando” genes de resistencia a diversos quimioterápicos. El uso de un antibiótico provoca la selección automática de las demás resistencias a otros antibióticos, ya que los genes responsables respectivos forman parte del mismo replicón, que además, al ser en muchos casos de tipo conjugativo, puede diseminarse a otras cepas de la misma o de diferentes especies.

            En muchos países se usan antibióticos como suplementos de dieta para los animales domésticos. Se ha comprobado que esto es también una fuente de transmisión de cepas resistentes a humanos.

            Otra cuestión evolutiva, aún no resuelta, es la del origen último de los genes de resistencia que tan fácilmente parecen transferirse entre especies bacterianas. Una hipótesis es que proceden de bacterias del suelo del grupo de los Actinomicetos, sobre todo del género Streptomyces, que son típicos productores de antibióticos, y que poseen de modo natural mecanismos de resistencia para evitar que el antibiótico que producen les afecte negativamente.

4.4        CONJUGACION EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS

            Hasta ahora, y a diferencia de Gram negativas, se han encontrado pocos sistemas conjugativos en Gram positivas. Existen ejemplos de plásmidos autotransmisibles en especies de Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium y Streptomyces, y todos ellos son bastante diferentes de lo estudiado en Gram negativas. Por ejemplo, en ninguno de estos hay implicación de pelos sexuales.

            Los plásmidos conjugativos de los cocos en cadenas (géns. Streptococcus y Enterococcus) han recibido cierta atención en los últimos años.

4.5        TRANSPOSONES CONJUGATIVOS EN ENTEROCOCCUS

            En E. faecalis y otros cocos Gram positivos se ha descubierto una clase especial de transposones que tienen la curiosa propiedad de inducir conjugación entre dos células para transponerse desde el cromosoma de la donadora al de la receptora, pero sin producir transferencia de marcadores cromosómicos. El mecanismo aún se desconoce en detalle, pero parece que implica la circularización del transposón al escindirse del genóforo donador. Al parecer, esta clase de transposones conjugativos son los principales responsables de la diseminación de resistencias a antibióticos entre cepas de estos estreptococos y a otras bacterias Gram-positivas. Ej.: Tn916, que codifica Tet^r y que mide unas 16 kb.

4.6        TRANSFERENCIA CONJUGATIVA ENTRE REINOS

            Un sorprendente sistema de intercambio de material genético nada menos que entre una bacteria y plantas superiores lo tenemos en el caso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que parasita una amplia diversidad de plantas dicotiledóneas. Como el estudiante verá en la sección de Taxonomía bacteriana, esta bacteria provoca el llamado “tumor en agalla” en los tallos de muchas plantas, debido a que posee un plásmido llamado Ti (iniciales inglesas de “inducción de tumoración (=agalla en corona)”. Los productos de ciertos genes del plásmido Ti detectan la presencia de la planta, y activan a los genes tra, que promueven la transferencia a la célula vegetal de un segmento del plásmido denominado ADN-T. Dicho ADN-T se integra en el genoma vegetal, y allí los genes que lleva, que son de tipo eucariótico, obligan a la planta a fabricar hormonas vegetales (responsables del crecimiento incontrolado de las células de la planta) y a fabricar unas sustancias (las opinas) que sólo puede usar la bacteria como fuente de C y energía. Estamos ante un extraordinario caso de “colonización genética” de una bacteria sobre un organismo superior.

            Los humanos hemos aprendido, a nuestra vez, a “domesticar” el sistema del plásmido Ti, de modo que actualmente, a partir de él se puede realizar Ingeniería Genética de plantas. La mayor parte de las plantas transgénicas están obtenidas con algún sistema de plásmidos artificiales derivados de Ti, que funcionan como vectores para introducir genes foráneos en una amplia diversidad de especies vegetales.

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